Témakiírások
Neosartorya fajok által termelt β-defenzin-szerű „bubble proteinek” (NBP) molekuláris biológiájának és biológiai szerepének vizsgálata
témakiírás címe
Neosartorya fajok által termelt β-defenzin-szerű „bubble proteinek” (NBP) molekuláris biológiájának és biológiai szerepének vizsgálata
intézmény
doktori iskola
témakiíró
tudományág
témakiírás leírása
A β-defenzineket, a veleszületett immunitás másodlagos védelmi rendszerének tagjait az 1980-as évek elején fedezték fel magasabbrendű élőlényekben. Az 1990-es évek második felétől néhány, a β-defenzinek szerkezetéhez (5 antiparallel β-lemez 3 hurokkal kapcsolva) hasonló antifungális peptidet (β-AP) izoláltak a tömlősgombák törzsébe tartozó fonalasgombákból. A fehérjék aminosavsorrendje eltérő, de konzervált homológ régiók megfigyelhetők. Ezek alapján két csoportot különíthetünk el: peptidek a Penicillium chrysogenum antifungális proteinre (PAF) jellemző klaszterrel; és peptidek a Penicillium brevicompactum “bubble protein”-re (BP) jellemző klaszterrel. Mindkét csoport gátolja számos gomba növekedését, illetve képesek antimikrobiálisan hatékony kölcsönhatásba lépni antifungális hatású szerekkel. A PAF klasztert hordozó peptidek a fonalasgombák, míg a BP klasztert hordozók az élesztők ellen hatásosak. Annak ellenére, hogy a peptidek által létrehozott antifungális hatás morfológiai megnyilvánulása megegyezik, feltételezések szerint eltérő biológiai hatásmechanizmus áll a háttérben, ami a mai napig nem teljesen tisztázott. Kimutatták, hogy a β-AP-k szerepet játszanak az aszexuális differenciálódásában, illetve feltételezzük, hogy szerepük lehet a tápanyagokért és az élőhelyért folytatott versenyben a hasonló ökológiai niche-t elfoglaló gombafajokkal szemben. Az ilyen peptidek eltérő rendszertani csoportokban történő jelenléte és filogenetikai kapcsolata a mai napig nem tisztázott. Előzetes munkánk során számos BP homológ gén jelenlétét mutattuk ki a Neosartorya nemzetség tagjai körében (Neosartorya bubble protein, NBP).
A doktori munka célkitűzései:
1. További BP klasztert hordozó β-AP-ket kódoló gének azonosítása a Neosartorya nemzetség tagjai körében, filogenetikai kapcsolatuk meghatározása.
2. Az új NBP-k in vitro antifungális tulajdonságainak vizsgálata.
3. Az NBP-k hatásmódjának vizsgálata.
4. A szerkezet-hatásmód-hatékonyság összefüggés feltárása az NBP-k esetén.
5. Az NBP-k biológiai szerepének vizsgálata.
1. év (1., 2., 3. pont):
Az NBP proteineket kódoló homológ gének polimeráz láncreakció (PCR) segítségével; a promóter és a terminális régióik inverz PCR-rel meghatározhatók. A proteinek cDNS-einek nukleotidsorrendje reverz transzkripción alapuló PCR termékekből megállapítható, és a hipotetikus protein szekvencia előre jelezhető. A munka hátterét a Szeged Microbial Collection biztosítja. Az NBP-k között fennálló filogenetikai kapcsolat a neighbour-joining-, a maximum parsimony-, a maximum likehood módszerrel, és a Bayes-féle statisztikai analízissel feltárható. Az ismert β-AP-ket kódoló gének promóter régiója számos stressz hatásra termelődő, transzkripciót szabályozó elem kötőhelyét tartalmazza. Az új NBP-ket kódoló gének promóter régióinak tanulmányozásával a proteinek termelődését elősegítő tápközeg összetétele meghatározható és ebből tisztíthatók. Az izolált NBP-k N-terminális szekvenálással, MALDI-TOF analízissel azonosíthatóak. Az új NBP-k antimikrobiális spektruma diffúziós és dilúciós eljárásokkal hatékonyan vizsgálható. Az NBP-k antimikrobiális hatásmechanizmusa az érzékenynek mutatkozó gombafajokon 4''-6-Diamidino-2-phenylindole- és calcofluor white-festéssel, illetve Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit-tel (Sigma) vizsgálható, továbbá a feltételezett támadáspontok inhibitorainak (pl. guanidin nukleotid analógok, kitin, ioncsatorna blokkolók) alkalmazásával.
2. év (4. pont):
A PAF antimikrobiális tulajdonságainak létrejöttéhez elengedhetetlen a megfelelő térszerkezet kialakulása. Ennek alapján feltételezzük, hogy képesek vagyunk eltérő antimikrobiális hatékonysággal és aktivitással rendelkező szerkezeti mutáns proteineket létrehozni és feltárni a szerkezet-hatásmód-hatékonyság közötti összefüggést. A proteinek antifungális tulajdonságának kialakításában szerepet játszó szerkezeti doménekben létrehozott véletlenszerű vagy helyspecifikus mutagenezis alkalmas lehet erre a célra.
Munkánk során először optimalizáljuk Pichia pastoris-ban az NBP-k heterológ módon történő termelését (EasySelect Pichia Expression Kit, Invitrogen). Az NBP-k in silico prediktált modellje alapján véletlen és helyspecifikus mutagenezissel létrehozunk egy mutánsgyűjteményt. A szerkezeti mutáns NBP-k (mNBP) antimikrobiális tulajdonságainak változása az 1. év módszereivel vizsgálható. Az mNBP-k P. pastoris-ban megtermeltethetők. Az mNBP-k szerkezete NMR vizsgálatokkal meghatározható.
3. év (5. pont):
Feltételezésünk bizonyítására, hogy az NBP-k fontos szerepet játszhat a differenciálódásban és az élőhelyért folytatott versenyben, az NBP-t termelő izolátumok, NBP-t kódoló génben deléciós mutánsait állítjuk elő. A fentebb tárgyalt szempontból nézett biológiai szerepükről a vad és a deléciós törzsek differenciálódásának, növekedésének a vizsgálata; illetve a deléciós és vad típusú törzsekkel az adott proteinre érzékeny és ellenálló, hasonló ökológiai niche-t elfoglaló gomba izolátumokkal szemben végzett in vitro antagonizmus tesztek nyújthatnak információt.
Eredményeink adatot szolgáltatnak a β-AP-k szélesebb körű jelenlétéről a fonalasgombák körében és a filogenetikai kapcsolatukról. Az NBP-k esetén a szerkezet-hatásmód-hatékonyság összefüggés feltárása, biológiai szerepük és hatásmechanizmusuk vizsgálata mind elméleti és gyakorlati szempontból fontos lehet, lehetőséget teremtve új, hatékonyan alkalmazható antifungális szerek kifejlesztésére. Tekintettel arra, hogy a β-defenzin-szerű molekulák széles körben elterjedtek az élővilágban, kitűzött céljaink teljesítése mikrobiológiai problémákon túlmutató kérdésekre is választ adhatnak.
Ajánlott szakirodalom:
Theis, T. and Sthal, U. (2004) Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications. Cell. Mol. Life Sci. 61: 437-244.
Galgóczy, L., Kovács, L. and Vágvölgyi, Cs. (2010) Defensin-like antifungal proteins secreted by filamentous fungi. In: Méndez-Vilas, A. (szerk.) Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology Vol. 1, Microbiology Book Series-Number 2. Badajoz: Formatex Research Center, 2010. pp. 550-559. (ISBN: 978-84-614-6194-3)
A doktori munka célkitűzései:
1. További BP klasztert hordozó β-AP-ket kódoló gének azonosítása a Neosartorya nemzetség tagjai körében, filogenetikai kapcsolatuk meghatározása.
2. Az új NBP-k in vitro antifungális tulajdonságainak vizsgálata.
3. Az NBP-k hatásmódjának vizsgálata.
4. A szerkezet-hatásmód-hatékonyság összefüggés feltárása az NBP-k esetén.
5. Az NBP-k biológiai szerepének vizsgálata.
1. év (1., 2., 3. pont):
Az NBP proteineket kódoló homológ gének polimeráz láncreakció (PCR) segítségével; a promóter és a terminális régióik inverz PCR-rel meghatározhatók. A proteinek cDNS-einek nukleotidsorrendje reverz transzkripción alapuló PCR termékekből megállapítható, és a hipotetikus protein szekvencia előre jelezhető. A munka hátterét a Szeged Microbial Collection biztosítja. Az NBP-k között fennálló filogenetikai kapcsolat a neighbour-joining-, a maximum parsimony-, a maximum likehood módszerrel, és a Bayes-féle statisztikai analízissel feltárható. Az ismert β-AP-ket kódoló gének promóter régiója számos stressz hatásra termelődő, transzkripciót szabályozó elem kötőhelyét tartalmazza. Az új NBP-ket kódoló gének promóter régióinak tanulmányozásával a proteinek termelődését elősegítő tápközeg összetétele meghatározható és ebből tisztíthatók. Az izolált NBP-k N-terminális szekvenálással, MALDI-TOF analízissel azonosíthatóak. Az új NBP-k antimikrobiális spektruma diffúziós és dilúciós eljárásokkal hatékonyan vizsgálható. Az NBP-k antimikrobiális hatásmechanizmusa az érzékenynek mutatkozó gombafajokon 4''-6-Diamidino-2-phenylindole- és calcofluor white-festéssel, illetve Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit-tel (Sigma) vizsgálható, továbbá a feltételezett támadáspontok inhibitorainak (pl. guanidin nukleotid analógok, kitin, ioncsatorna blokkolók) alkalmazásával.
2. év (4. pont):
A PAF antimikrobiális tulajdonságainak létrejöttéhez elengedhetetlen a megfelelő térszerkezet kialakulása. Ennek alapján feltételezzük, hogy képesek vagyunk eltérő antimikrobiális hatékonysággal és aktivitással rendelkező szerkezeti mutáns proteineket létrehozni és feltárni a szerkezet-hatásmód-hatékonyság közötti összefüggést. A proteinek antifungális tulajdonságának kialakításában szerepet játszó szerkezeti doménekben létrehozott véletlenszerű vagy helyspecifikus mutagenezis alkalmas lehet erre a célra.
Munkánk során először optimalizáljuk Pichia pastoris-ban az NBP-k heterológ módon történő termelését (EasySelect Pichia Expression Kit, Invitrogen). Az NBP-k in silico prediktált modellje alapján véletlen és helyspecifikus mutagenezissel létrehozunk egy mutánsgyűjteményt. A szerkezeti mutáns NBP-k (mNBP) antimikrobiális tulajdonságainak változása az 1. év módszereivel vizsgálható. Az mNBP-k P. pastoris-ban megtermeltethetők. Az mNBP-k szerkezete NMR vizsgálatokkal meghatározható.
3. év (5. pont):
Feltételezésünk bizonyítására, hogy az NBP-k fontos szerepet játszhat a differenciálódásban és az élőhelyért folytatott versenyben, az NBP-t termelő izolátumok, NBP-t kódoló génben deléciós mutánsait állítjuk elő. A fentebb tárgyalt szempontból nézett biológiai szerepükről a vad és a deléciós törzsek differenciálódásának, növekedésének a vizsgálata; illetve a deléciós és vad típusú törzsekkel az adott proteinre érzékeny és ellenálló, hasonló ökológiai niche-t elfoglaló gomba izolátumokkal szemben végzett in vitro antagonizmus tesztek nyújthatnak információt.
Eredményeink adatot szolgáltatnak a β-AP-k szélesebb körű jelenlétéről a fonalasgombák körében és a filogenetikai kapcsolatukról. Az NBP-k esetén a szerkezet-hatásmód-hatékonyság összefüggés feltárása, biológiai szerepük és hatásmechanizmusuk vizsgálata mind elméleti és gyakorlati szempontból fontos lehet, lehetőséget teremtve új, hatékonyan alkalmazható antifungális szerek kifejlesztésére. Tekintettel arra, hogy a β-defenzin-szerű molekulák széles körben elterjedtek az élővilágban, kitűzött céljaink teljesítése mikrobiológiai problémákon túlmutató kérdésekre is választ adhatnak.
Ajánlott szakirodalom:
Theis, T. and Sthal, U. (2004) Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications. Cell. Mol. Life Sci. 61: 437-244.
Galgóczy, L., Kovács, L. and Vágvölgyi, Cs. (2010) Defensin-like antifungal proteins secreted by filamentous fungi. In: Méndez-Vilas, A. (szerk.) Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology Vol. 1, Microbiology Book Series-Number 2. Badajoz: Formatex Research Center, 2010. pp. 550-559. (ISBN: 978-84-614-6194-3)
felvehető hallgatók száma
1 fő
helyszín
SZTE Mikrobiológiai T
jelentkezési határidő
2013-08-07