Thesis supervisor: Róbert Katona
Location of studies (in Hungarian): MTA SZBK, Genetikai Intézet, Mesterséges Kromoszóma és Őssejt Kutató Labor Abbreviation of location of studies: SzBK
Description of the research topic:
ELŐZMÉNYEK
1991-ben jelent meg először a tervezett emlős mesterséges kromoszóma, mint új technológia. A nem integrálódó, biztonságos, autonóm módon replikálódó, mitótikusan és meiótikusan is stabil, szinte korlátlan génhordozó kapacitású kromoszómális vektor ötlete azonnal nagy népszerűségre tett szert. A világ számos kutatócsoportja fogott neki, hogy a saját módszerével mesterséges emlőskromoszómát hozzon létre. A MAC vektorok felhasználási területe igen széleskörű. Az alapkutatás kiváló alapanyagai, mivel segítségükkel tanulmányozhatjuk a kromoszómák szerkezetét és stabilitását, a kromatin összeszerelődését, a centromer és a kinetokor szerveződését, a telomerek fenntartását, a kromoszómák mozgását, replikációját és szegregációját. Képesek vagyunk több gént is feltölteni a MAC-re és így teljes biokémiai és szignál transzdukciós útvonalak is tanulmányozhatók egyetlen genetikai vektor segítségével. Ezek az útvonalak aktív és inaktív formában is tanulmányozhatók, ha indukálható promótereket és/vagy géncsendesítési módszereket alkalmazunk. Egyéb genetikai vektorokkal ellentétben (vírusok, plasmidok, transposonok, PAC, BAC és YAC vektorok) a MAC vektorokba egy gén teljes genomi szekvenciáját az intronokkal és az összes szabályozó elemmel együtt be lehet építeni, és így biztosíthatjuk a gén megfelelő szintű, vad típusú kifejeződését térben és időben. Ha szintetikus vagy természetes genetikai faktorokat töltünk a MAC-re, akkor rávehetjük pluripotens és/vagy multipotens őssejteket arra, hogy bizonyos specifikus differenciálódási irányba elköteleződjenek, és így specifikus sejttípusokat hozhatunk létre. Ezek a tanulmányok feltárhatják, hogy az ős- és progenitor sejtekből hogyan alakulnak ki a szervezet bizonyos sejttípusai. Ezen felül, ezek a differenciálódott sejttípusok alkalmasak lehetnek sejtterápiára. A MAC vektorok jelző géneket is kifejezhetnek, amelyek segítségével elválaszthatjuk egymástól a differenciálódott sejttípusokat és a differenciálatlan őssejteket. Öngyilkos géneket is beépíthetünk a mesterséges kromoszómákba és ezzel a génterápia biztonságosabbá tehető. Monogénes és poligénes genetikai mutációk is kijavíthatók a betegek sejtjeiben, ha a sejtterápiás eljárás elvégzése előtt olyan MAC-et juttatunk be a beteg sejtekbe, amely hordozza és kifejezi a mutáns gén vad típusú változatát. Ez az eljárás lehetőséget biztosít a személyre szabott gén- és sejtterápiára. Az utóbbi időben felfedezték, hogy bizonyos felnőtt ős- és progenitor sejtek képesek a szervezetben található daganatokhoz vándorolni és főként a daganatok közelében felhalmozódni. Ez a jelenség lehetővé teszi, hogy a MAC vektorokat daganatterápiára is felhasználjuk. A MAC-et daganat ellenes ellenanyagok és olyan enzimek génjével töltjük fel, amelyek inaktív gyógyszeralapanyagokat aktív, daganatölő gyógyszerekké alakítanak. Az így feltöltött MAC vektorokat pedig az említett ős- és progenitor sejtekbe juttatjuk, majd ezeket a sejteket sejtterápia során a daganatok elpusztítására használjuk fel.
FOLYÓ KUTATÁS
A kombinált mesterséges kromoszóma-őssejt daganatterápia az őssejtek azon természetes tulajdonságára épül, hogy ha egy felnőtt szervezet véráramába juttatjuk őket, akkor elsősorban a daganatokhoz vándorolnak és ott a daganatok sejtjei között megtelepednek. Ha ezek az őssejtek egy olyan mesterséges kromoszómát hordoznak, amelyen a terápiás gének alkalmasak a daganatsejtek szelektív elpusztítására, lehetőség nyílik a daganatok hatékony „genetikai sebészettel” történő eltávolítására.
Az itt javasolt prototípus értékű kísérletekben az anti-Her2 monoklonális ellenanyagot (Trastuzumab) és a karboxilészteráz enzimet (CE) használjuk a daganatsejtek elpusztítására.
1. A Her2/Neu (ErbB2) gén amplifikációja a korai állapotú emlődaganatok 20-30%-ában fordul elő. A Trastuzumab (anti-Her2) egy humanizált monoklonális ellenanyag, amely az ErbB2 receptor extrecelluláris szegmentjének IV-es számú doménjéhez kötődik. A Trastuzumab-bal kezelt sejtek a sejtciklus G1 fázisában megrekednek, így a sejtek szaporodása gátolt. Az anti-Her2 a daganatokban az új erek képződését, az angiogenezist is gátolja. A daganatsejtek „éhezése” miatt a daganatok növekedése leáll, méretük csökken, kedvező esetben a daganatok eltűnnek. Az anti-Her2 jelenléte a tumorsejtek felszínén immunválaszt vált ki, amely a tumorsejtek elpusztítását eredményezi. Kísérleti stratégiánkban az anti-Her2 ellenanyag génjét egy a sejtközötti térbe kiválasztó szignál szekvenciával együtt a mesterséges kromoszómára építjük, amely funkcionálisan termelni fogja az ellenanyagot, amely a daganatokban a sejtközötti térbe jutva a daganatsejtek növekedésének gátlását és végső soron pusztulását okozza.
2. A kísérleti stratégiánk másik eleme a sejtközötti térbe ürülő humán karboxilészteráz (CE) gén mesterséges kromoszómába építése és túltermelése. A CE hidrolízis segítségével képes egy semleges vegyületet (Irinotecan, CPT-11) egy hatékony sejtméreggé (SN-38) átalakítani. Az SN-38 a topoizomeráz-I működését gátolja, ami végső soron mind a DNS replikáció, mind pedig a transzkripció gátlását eredményezi, ami a daganatsejtek pusztulását okozza.
KITŰZÖTT CÉLOK
Az anti-Her2 és CE fehérjéket termelő mesterséges kromoszómákat pluripotens őssejtekbe juttatjuk be. Az így kapott terápiás őssejteket neuronális őssejtté (NSC) és/vagy mezenhimális őssejtté (MSC) differenciáltatjuk, majd részben ex vivo sejtes kísérletekben használjuk őket. Később pedig emlődaganatos egerek véráramába injektáljuk őket és a kombinált mesterséges kromoszóma-őssejt daganatterápia eredményességét a daganatok visszahúzódásának, eltűnésének mértékével és a kezelt egerek túlélésének vizsgálatával értékeljük ki. A minimális maradványbetegség a hagyományos daganatkezelés során gyakorta előfordul, mint visszatérő megbetegedés. Ebben az esetben a hagyományos kezelések már rendszerint nem segítenek, mert a tumorsejtek ellenállnak mindenféle kezelési eljárásnak. Az általunk javasolt protokoll nagy valószínűséggel alkalmas a minimális maradványbetegség kialakulásának megakadályozására. Egérmodell kísérletek segítségével próbáljuk ezt az állítást bizonyítani.
MEGTANULHATÓ/ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
-molekuláris klónozás
-kompetens baktérium sejtek transzformációja
-plazmid tisztítás és emésztés restrikciós enzimmel
-emlőssejt tenyésztés
-emlős őssejt tenyésztés
-őssejt differenciáció
-emlős sejtek transzfekciója genetikai anyaggal
-gének feltöltése a SATAC-ra
-polimeráz láncreakció (PCR) alapú genotipizálás
-Fluoreszcenc in situ hibridizáció (FISH)
-Fluoreszcens mikroszkópia
-Fluoreszcencián alapuló sejtválogatás (FACS)
-Western kísérletek
-daganatos egérmodell előállítása
-állatházi állatok tartása, kezelése
Required language skills: angol Recommended language skills (in Hungarian): angol Further requirements: Előny a következő technikák ismerete: molekuláris klónozás, kompetens baktérium sejtek transzformációja, plazmid tisztítás és emésztés restrikciós enzimmel , emlőssejt tenyésztés, emlős sejtek transzfekciója genetikai anyaggal, polimeráz láncreakció
Login
