Nyomás-perturbációs kalorimetriai és nagy nyomású EPR spektroszkópiai módszerek alkalmazása membránfehérjék és lipid-fehérje kölcsönhatás tanulmányozására
témavezető: Páli Tibor
helyszín (magyar oldal): ELKH Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Biofizikai Intézet helyszín rövidítés: SZBK
A kutatási téma leírása:
A nyomásperturbációs kalorimetria (PPC) egy új technika az oldatban lévő biomolekulák térfogati tulajdonságainak tanulmányozására. A biomolekula fajlagos térfogatának hőtágulási együtthatóját kis izotermikus nyomásugrások után felhasznált vagy felszabaduló hőből származtatjuk. Ez nagymértékben függ a biomolekula konformációjától és belső dinamikai tulajdonságaitól, valamin az oldószerrel való kölcsönhatásától. A PPC érzékeny a lipidmembrán állapotára, a lipid-fehérje kölcsönhatás változásaira és a biomolekulák hidratációs héjára is, ami meghatározó a szerkezet szempontjából. Ugyanakkor magas nyomású (HP) technikák felfedhetik a fehérjék rugalmas régióit az egyes konformációs állapotokon belül, de elmozdíthatják a konformációs egyensúlyokat is, így a „láthatatlan" gerjesztett állapotok hozzáférhetővé válnak spektroszkópiai jellemzés céljából. A nagy nyomást kombinálva helyspecifikusan spinjelzett fehérjék EPR spektroszkópiájával, olyan adatok nyerhetőek, mint: egy natív fehérje rugalmas régiói, egyensúlyi konformációs állapotok, normál nyomáson nem észlelhető gerjesztett állapotok és strukturális heterogenitás mértéke. A PPC és magas nyomású technikák kevés alkalmazást találtak eddig membránokon és membránfehérjéken. Ezeket a technikákat mikrokaloriméterünkön ill. EPR spektrométerünkőn realizáljuk, és tovább fejlesztjük azokat, kiválasztott vízoldható és membránfehérjék, valamint lipidekkel való kölcsönhatásuk mérése során. A munkaterv vázlata a következő:
• Mivel a mikrokaloriméter készülékünkhöz már nem áll rendelkezésre kereskedelni PPC, irodalmi példa alapján építünk egy PPC egységet [Seeger et al., 2007].
• PPC méréseket végzünk élesztő vakuólumon, vakuoláris vezikulákon és rekonstruált membránokon annak tesztelésére, hogy miként befolyásolja azok hőtágulási együtthatóját amikor a V-ATPáz nyugalmi vagy működő állapotban van, és amikor szabályozó, gátló molekulák kötődnek az enzimhez.
• Nagynyomású (HP) mintacellákat és nyomásszabályozókat telepítünk az EPR spektrométerünkre a HP EPR vizsgálatokhoz. A publikált példák referenciaként szolgálnak majd [ld. pl. Lerch és mtsai., 2015].
• HP EPR méréseket végzünk: a fenti mintákon, tiszta spin-jelzett membránokon lizozim enzim hiányában és jelenlétében, valamint a spinjelzett V-ATPáz alegységeken, amelyeket membránokba építünk.
előírt nyelvtudás: angol középfok felvehető hallgatók száma: 2
Bejelentkezés
