témavezető: Tulassay Zsolt
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
Előzmények
Korábbi vizsgálatainkban TV citophotometriával kimutattuk a gyomornyálkahártyában a Helicobacter pylori fertőzés következtében kialakuló aneuploidiát (1), a fokozott epithelium sejtproliferációt, apoptosist (2,3), igazoltuk, hogy a p53 szint növekszik (4) és változik az EGFR szintje is (5). Kvantitatív PCR- módszerrel meghatároztuk a helyi gyomornyálkahártya elváltozásokhoz kapcsolódó Helicobacter felhalmozódást és növekedett koncentrációt (6,7). Fölvetődik annak a lehetősége, hogy kapcsolat mutatkozik a H. pylori fertőzés okozta nyálkahártya elváltozások és a HLA status között.
NSAID kezelésben részesülő betegek gyomornyálkahártyájában immunhisztokémiai módszerrel fokozott apoptosist mutattunk ki, amely COX-2 specifikus NSAID szerek alkalmazása esetén nem volt igazolható (8). Nem ismert az a folyamat sem, hogy az NSAID hatására miért cask a betegek 40-50 %-ában alakul ki nyálkahártya eltérés. Az eddigi módszerek (immunhisztokémia, PCR) nem teszi lehetővé azt, hogy a sejtműködés nagy számban párhuzamosan vizsgáljuk. Az emésztőrendszeri betegségei molekulárbiológiai vizsgálata, genetikai és génexpressziós hátterének megismerése segíthetik a kóros állapot kialakulásának pontosabb feltárását. A genetikai fogékonyság megállapítását segítő DNS alapú technológiákon kívül a különböző kórképekhez társuló mRNS és fehérjeszintű eltérések analízise is hozzájárulhat a molekulárisbiológiai alap tisztázásához.
Az expressziós microarray technológia nagy számú transzcriptum egyidejű semikvantitatív analízisre alkalmas. Klinikánon az affymetrix microarray rendszer segítségével mind az mRNS szintű (génexpressziós microarray), mind a DNS szekvenciát érintő (szekvenáló chipek) elváltozások vizsgálhatók. Az így nyert adatok egymással és a genetikai adatbáziokkal is összevethetők.
A Helicobacter pylori hatását eddig sejtkultúrákon elemezték (9-14). Humán biopsziás mintákon csak kis számú gént tartalmazó (1000-1500 gén) chipvizsgálatok történtek (15-16). Eddig humán gyomorbiopsziás mintákat feldolgozó összefoglaló munka teljes genom chipeket alkalmazva még nem készült.
Kutatási terv
- Módszerek és betegek
Az expressziós microarray vizsgálatokhoz az emésztőrendszeri endoszkópia során vett gyomorbiopsziás anyagot használjuk fel.
Az mRNS expresszióhoz RNS stabilizáló oldatban tárolt és gyors fagyasztott biopsziás mintákat, a DNS szekvenáláshoz paraffin blokkban tárolt, a hagyományos szövettani analízisre is szolgáló mintákat alkalmazunk.
- Konkrét mintagyűjtési tervek
Az endoszkópos vizsgálatok felnőtt és gyermekbetegekben történnek. A következő betegcsoportokat alakítjuk ki:
- Helicobacter pylori pozitív betegek: szabályos nyálkahártya, erosio, fekély.
- Helicobacter pylori negatív betegek: szabályos nyálkahártya, erosio, fekély.
- NSAID szedő betegek, Helicobacter pylori pozitívitással: szabályos nyálkahártya, erosio, fekély.
- NSAID szedő betegek, Helicobacter pylori negatív statussal: szabályos nyálkahártya, erosion, fekély.
A betegcsoportokat életkor szerint is különválasztjuk (gyermekkor, felnőttkor). A gyomornyálkahártya biopszián kívül perifériás vérből RNS vizsgálatra is történik mintagyűjtés.
A vizsgálatok elvégzéséhez TUKEB engedélyt kérünk.
- mRNS expressziós analízis
párhuzamosan a hagyományos szövettanra vett biopsziákkal, a microarray vizsgálat céljára RNS konzerváló oldatba veszik le biopsziákat.
a mintákból teljes RNS vonunk ki Qiagen RNeasy Mini kittel.
az izolált RNS-ből - minőségi és mennyiségi ellenőrzés után - biotinnal jelölt komplementer RNS (cRNS) próbákat szintetizálunk az Affymetrix GeneChip One-Cycle Target Amplification, Labeling and Control Reagents kittel a gyártó leírása szerint.
a jelölt cRNS próbákat Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 teljes genom microarray-re hibridizáljuk(17).
- Bioinformatikai analízis
Az észlelt fluoreszcencia intenzitás adatokból származó adatfile-okat statisztikailag elemezzük.
o A microarray-k minőségi ellenőrzése a „Tumour Analysis Best Practices Working Group” ajánlása alapján történik (18-21).
o Két különböző normalizációs módszert alkalmazunk: MAS 5.0 és RMA.
o „Prediction Analysis for Microarrays” (PAM) analízist végzünk.
o A hierarchikus cluster analízist a Genesis szoftverrel végezzük.
o Az annotáció az Affymetrix Netaffx analízis centrum felhasználásával történik.(http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx).
- Szignál transzdukciós út analízis
Mivel a bioinformatikai analízis nem kulcskapcsoló gének halmazát adja meg, hanem a szignáltranszdukciós kaszkád végein ülő, már nagyon felerősített génekét, ezért az un. gatekeeper, kulcskapcsoló génnek visszakeresése lényeges.
Ehhez un. pathway analízist, szignáltranszdukciós út analízist végzünk, amelyhez Stratagene, PathwayAssist programcsomagját használjuk.
- Megerősítő vizsgálatok
Az mRNS expressziós vizsgálatok eredményeit quantitativ, real-time multiplex RT-PCR (Tagman-Array) és immunhisztokémiai (Tissue Microarray) vizsgálatokkal erősítjük meg.
A megerősített géneket a bioinformatikai analízis után adjuk meg. Ennek száma tagman arrayen elérheti a 96-ot is. Szöveti mikroblokk technikát alkalmazva (TMA) egy 144 szöveti mintát tartalmazó mikroblokkot állítunk elő a biopsziás mintákból és ezeket vizsgáljuk immunhisztokémiával.
- Statisztikai analízis
A statisztikai analízist (factor, diszkriminancia analízis) R és Bioconductor programcsomaggal végezzük.
Ezáltal utat mutathatnak, hogy a szövettani diagnózis helyette mRNS expressziós pattern alapján lehet-e csoportosítani a beteg mintákat.
- Várható eredmények
A Helicobacter pylori fertőzött és nem fertőzött gyomornyálkahártya génmintázatainak eltérése, ezek összehasonlítása, és a korábbin immunhisztokémiai eredményekkel való összefüggésének vizsgálata.
A Helicobacter pylori fertőzés során kialakult gyomornyálkahártya eltérés génexpressziós vizsgálata.
E génexpressziós mintázat eltérés vizsgálata különböző életkorban.
A különböző életkorban tapasztalt Helicobacter pylor pozitív és negativ fekélyek során kimutatható génexpressziós mintázatbeli eltérések vizsgálata.
A Helicobacter pylori fertőzés kialakulásában szerepet játszó HLA csoportok vizsgálata.
A Helicobacter pylori fertőzéssel összefüggő egyéb génexpressziós eltérések elemzése.
Az NSAID kezelés során kialakuló nyálkahártya eltérések molekulárbiológiai vizsgálata egyidejű Helicobacter pylori fertőzés alkalmával.
A szignál transzdukciós út analízise olyan gének azonosítását is lehetővé teheti, amelyek a fent leírt folyamatokban irányító szerepet töltenek be.
Ha a biopsziás anyagból kapott marker gének a perifériás verbena a is expresszálódnak, akkor a perifériás vérminták mRNS mintázatának vizsgálatával újfajta mRNS alapú tesztekhez juthatunk.
felvehető hallgatók száma: 3
Jelentkezési határidő: 2020-05-20
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
