Thesis supervisor: Nóra Szentmáry
Location of studies (in Hungarian): SE Abbreviation of location of studies: SE
Description of the research topic:
Bevezető
A látás megőrzése szempontjából létfontosságú az átlátszó, érmentes szaruhártya (cornea). A szaruhártya hám fenntartását és így a cornea átlátszóságát a szaruhártya és a kötőhártya határán elhelyezkedő, őssejteket termelő úgynevezett limbus-zóna biztosítja. Abban az esetben, ha a limbus őssejt populációja károsodik (gyulladás, degeneratio, sérülés), a sokszorozó sejtkészlet hamar „kimerül”és a cornea hám, -ezzel együtt a látásfunkció fenntartása- lehetetlenné válik. Munkánk célja, hogy limbális őssejt károsodás esetén, a sérült őssejt készletet laboratóriumi körülmények között növesztett őssejt populációval pótolhathatóvá tegyük, a klinikai gyakorlat számára.
A sejttechnológiai módszerek fejlődésével egyre több laboratóriumban próbálnak limbális őssejteket izolálni, felszaporítani és a károsodott szem felszínére visszajuttatni, azonban a limbális ős- és sokszorozó sejtek alapvető élettani tulajdonságai mind a mai napig nem ismertek.
- A limbális őssejtek immuncitokémiai „markereinek” azonosítása nem megoldott
- Nem ismert az a növekedési faktor-spektrum, amely az őssejtek, sokszorozó sejtek fennmaradását, illetve a fiatal epithel sejtek differenciálódását támogatja
- Nem ismerjük a felszaporítandó limbális sejtek letapadási képességeit, ezért laboratóriumi körülmények között és a szemfelszínre való felvitel esetén is igen különböző felületekkel próbálkoznak.
Előzetes vizsgálataink szerint, multiorgan donorokból származó cornea epitheliumból sikerült osztódó szaruhártya-sejteket nyernünk. Megállapítottuk, hogy az irodalmi adatokból ismert 3T3 és fibroblaszt sejtek mellett, a perinatális asztroglia sejtek is termelnek olyan faktorokat, amelyek a basalis limbális sejtek in vitro életben maradását és növekedését serkentik Azt is sikerült megmutatnunk, hogy egy szintetikus adhezív peptid (AK-c(RGDfC) alkalmazásával a limbusból nyert sejtek letapaszthatók állati vagy human eredetű (tisztázatlan bioadditív) faktorok nélkül, ami nagyban segítheti egy kémiailag jól jellemzett eljárás klinikai célú kidolgozását.
Rövid munkaterv
Multiorgan donorokból cornea és limbus mintákat (~1-3 mm3) emelünk ki. A szövetmintákból egyedi sejtek szuszpenzióit állítjuk elő, és vizsgáljuk tovább. A sejt-együttes összetételét – a limbális őssejtek, elkötelezett sokszorozó sejtek, differenciálódó/differenciált keratinociták arányát - immuncitokémiai eljárásokkal, sejt-proliferáció mérésekkel jellemezzük. A tenyészetekben szaporodó sejtekből egyetlen sejt-eredetű sejtpreparátumokat szaporítunk fel.
Az előző munka során izolált sejtklónok közül a kromoszómaszám stabilitásának vizsgálatával kizárjuk az instabil – nagy valószínűséggel tumorosan transzformált sejtvonalakat. A vizsgálatok alapján őssejt-sajátságokat hordozó stabil klónokat vizsgáljuk tovább.
A szaporodást segítő környezetben hosszú időn át változatlanul fenntartható, de indukciós hatásokra epithel irányba differenciálódó klónokat megfelelő adhezív bevonattal ellátott hordozón növesztjük. Megkeressük azt a bevonat-gradienst, amely kielégíti a fokozatosan differenciálódó epithel sejtek letapadási igényeit, és képes a differenciálódó sejtek „megvezetésére”.
Az alkalmas klónok sejtjeit hordozó felületen, vagy sejtszuszpenzió formájában kísérleti állatok limbus-régiójába juttatjuk. Ehhez nyúlakon – és reményeink szerint patkányon – szemsebészeti eljárást dolgozunk ki. A szükséges etikai engedélyek kérelme folyamatban van. Különböző túlélési periódusok után, a kísérleti állatokat túlaltatjuk, majd a szem kiemelése után, optikai és szövettani módszerekkel vizsgáljuk a bevitt sejtek cornea-integrációját.
Várható eredmény:
Reményeink szerint, standardizálhatóvá válhat a limbális őssejtek tenyésztési módszere és megkezdődhet a limbális sejtek ex vivo expanziót és szelekciót követő klinikai beültetése szemfelszín rekonstrukció céljából.
Együttműködő kutatóhely
A sejttenyésztéshez és sejtbiológiai feladatok megoldásához a megfelelő technikai hátteret (laminár boksz, termosztát, ultracentrifuga, FACS, mikroszkóp-rendszerek, RT-PCR lehetőségek, állatmodellek és implantációs technikák stb.) az MTA Központi Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézete Idegi Sejt- és Fejlődésbiológiai Laboratórium (vezető: Dr. Madarász Emília) biztosítja.
jából.
Login
