témavezető: Paragh György
helyszín (magyar oldal): DE Belgyógyászati Intézet I.sz. Belgyógyászati Klinika helyszín rövidítés: IBelK
A kutatási téma leírása:
1.Irodalmi előzmények
Újabban vált ismert az a tény, hogy a gyulladások és a kardiovascularis megbetegedések között szoros összefüggés áll fenn, bár ennek a kapcsolatnak a tisztázása csak részben történt meg (1). Az jól ismert, hogy ateroszklerózisban gyulladásos folyamatok játszódnak le az érfalban, és ennek megfelelően a citokinek szintje megemelkedik a szérumban. Annak a mechanizmusa azonban már kevésbé ismert, hogy egyéb gyulladásos folyamatok révén felszabaduló citokinek milyen mechanizmus alapján képesek hatni az ateroszklerózis kialakulására a kompetens sejtek (monocita/makrofág rendszer, vascularis simaizomsejtek, májsejtek) endogén koleszterin homeosztázisának megzavarásán keresztül.
Az is ismert, hogy bizonyos citokinek, mint az Interleukin-1β, a tumor necrosis factor-α, vagy az Interleukin-6 a p47PHOX-ot foszforilálva képesek a NADPH oxidase enzim aktiválására. A citokinek által kiváltott fokozott szabadgyök termelődés fontos komponense az atheromás plaque képződésnek (2). A fokozott szabadgyök termelődés kb. 70%-a a mevalonát cikluson keresztül következik be; in vivo és in vitro statinokkal gátolható (3,4). Ez felveti annak a lehetőségét, hogy a citokin-típusú receptorokkal rendelkező neuropeptidekhez hasonlóan a citokinek is fokozni képesek az endogén koleszterin szintézist (4). Természetesen, felvetődik az a kérdés, hogy a citokin-stimuláció szignalizációja milyen úton jut el a koleszterin homeosztázis zavaráig. Az endogén koleszterin termelődést - és az exogén felvételt is - a Goldstein munkacsoport által leírt Insig protein - sterol regulating element binding protein 2 (SREBP2) - SREBP cleavage activating protein (SCAP) rendszer szabályozza (5).
Végül, az általunk tervbe vett vizsgálatok fontosságát azok a klinikai megfigyelések is indokolják, melyek szerint a felnőtt életkor közepén jelentkező diabetes, elhízás, magasvérnyomás és hiperkoleszterinémia oka mai napig ismeretlen, és nem vezethető vissza csupán a nem megfelelő életmódra és táplálkozásra.
2. Célkitűzés
Vizsgálataink során a citokin-stimuláció zavaró hatását kívánjuk meghatározni az intracelluláris koleszterin homeosztázisára. Vizsgálatainkhoz az U-937 monocita, a VSMC érfal simaizom és a HepG2 máj sejtvonalakat választottuk, melyek mindegyike más-más szempontból, de hasznos információt ad a koleszterin homeosztázis zavarának jelentőségéről. A stimuláció három, u.n. „proinflammatory cytokine”-el, az Interleukin-6 (IL-6), a tumor necrosis factor-α (TNF-α) és az Interleukin-1β (IL-1β) segítségével történik. A citokinnel stimulált sejtekben szérum mentes médiumban megmérjük a statinnal gátolható szabadgyök képződést és koleszterin szintézist, a sejtek koleszterin tartalmának változását a stimulus hatására, végül a leadott koleszterin mennyiségét is meghatározzuk.
3. Kísérleti terv
3.1 Sejtvonalak
A vizsgálatokat U-937, VSMC, illetőleg HepG2 sejtvonalakon kívánjuk elvégezni.
3.2 Tervezett előkísérletek
A stimulációhoz használt IL-6, TNF-α és IL1-β megfelelő koncentrációit a sejtek fluvastatinnal gátolhat szuperoxid anion termelését alapul véve határozzuk meg. A megfelelő sejtvonalak és citokin koncentrációk kiválasztása után az alábbi kísérleteket kívánjuk elvégezni.
3.3 Kísérleti és módszerek
1. Szuperoxid anion termelés - fluvastatin jelenlétében is, Cohen and Chovaniek módszere szerint (6).
2. [14C]arahidonsavval feltöltött sejtekből a stimulus hatására kibocsátott lebontási termékek mérése, továbbá fluvastatin jelenlétében a statinnal gátolható arány meghatározása (7).
3. Koleszterin szintézis meghatározása [14C]acetát koleszterin frakcióba való beépülésének segítségével (8).
4. A sejtek szabad koleszterin tartalmának meghatározása (9).
5. Koleszterin leadás meghatározása [3H]koleszterin oleát felhasználásával (10).
6. Az SREBP2 és a SCAP fokozott szintézisének kimutatása a különböző sejtfrakciókból SDS-PAGE elektroforézis segítségével Botolin és mtsai módszerével (11).
3.4 Elvégzendő kísérletek
1. A citokinek megfelelő koncentrációival a vizsgálatokat mindhárom sejtféleségen elvégezzük, hiszen így kaphatunk kellő információt a monocita/makrofág rendszer, az érfal símaizomsejtjek és a májsejtek viselkedéséről.
2. A szérum-mentes közegben történő megfelelő stimulusok hatását vizsgáljuk a koleszterin szintézisre, a koleszterin szint változásra és a koleszterin leadásra. Összehasonlítást végzünk a különböző ligandok által kapott eredmények között, és különösen a háromféle sejtvonalon mért értékek között.
3. Amennyiben az eredmények azt tükrözik, hogy a citokinek és/vagy valamelyik citokin hatására az endogén koleszterin szintézis megnőtt, a továbbiakban megvizsgáljuk a koleszterin homeosztázist reguláló SREBP2 és SCAP mennyiségét a különböző sejt-kompartmentekben.
4. Várható eredmények
Eredményeink alapján véleményt alkothatunk arról, hogy kardiovaszkuláris megbetegedésekben milyen szerepet játszhatnak az immunfolyamatok hatására lokálisan, vagy generalizáltan felszabaduló proinflamációs citokinek.
5. Irodalomjegyzék
1. Robertson AK, Hanson GK. (2006) T cells in atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 2421-2432.
2. Touyz RM, Schiffrin EL. (2004) Reactive oxygen species in vascular biology: implications in hypertension. Histochem cell Biol 122: 339-352.
3. Seres I, Foris G, Pall D, Kosztaczky B., Paragh G Jr., Varga Z, Paragh G. (2005) Angiotensin II-induced oxidative burst is fluvastatin sensitive in neutrophils of patients with hypercholesterolemia. Metabolism 54: 1147-1154.
4. Kosztaczky B, Foris G, Seres I, Balogh Z, Fulop P, Koncsos P, Paragh G. (2006) neuropeptides 40: 309-316.
5. Nohturfft A, Brown MS, Goldtsein JL, (1998) Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with sterol-sensing domain. J Biol Chem 273: 17243-17250.
6. Cohen HJ, Chovaniek ME. (1978) Superoxide generation by digitonin-stimulated guinea pig granulocytes. J Clin Invest 61: 1088-1096.
7. Boraschi D, Censini S, Bartalini M, Tagliabue A. (1985) Regulation of arachidonic acid metabolism in macrophages by immune and non-immune interferons. J Immunol 135:502-505.
8. McNamara DJ, Boch CA, Botha A, Mendelsohn D. (1985) Sterol synthesis in vitro in freshly isolated blood mononuclear leukocytes from familial hypercholesterolemic patients treated with probucol. Biochem Biophys Acta 833: 412-419.
9. Goh EH, Krauth DK, Colles SM. (1990) Analysis of choleserol and demosterol in cultured cells without solvent extraction Lipids 25: 738-745.
10. Marmillot P, Patel S, Lakshman MR. (2007) Reverse cholesterol transport is regulated varying fatty acyl chain saturation and sphyngomyelin content in reconstituted high-density lipoproteins. Metabolism 56: 251-259.
11. Botolin D, Wang Y, Christian B, Jump DB. (2006) Docosahexaneoic acid (22:6,n-3) regulates rat heptocyte SREBP-1 nuclear abundance by Erk- and 26S proteosome-dependent pathways. J Lipid Res 47:181-192.
Témavezető: Prof. Dr. Paragh György, egyetemi tanár, Dr. Balogh Zoltán, egyetemi adjunktus
Bejelentkezés
