témavezető: Várnai Péter
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem Élettani Intézet helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
Célkitűzés
Kutatásunk célja olyan új, molekuláris alapokra épülő módszer kifejlesztése, melynek segítségével befolyásolni lehet a különféle inozitol lipidek (pl. PtdIns(4,5)P2, PtdIns(4)P PtdIns(3)P stb.) sejteken belüli mennyiségét a sejt egy jól definiált membrán kompartmentjében (pl. plazmamembrán, Golgi, ER, magmembrán, mitokondrium, endoszóma). A módszer jelentősége, hogy alkalmazásával további részleteket ismerhetünk meg az inozitol lipidek hatásait illetően, különös tekintettel a lokális különbségekre.
Az inozitol lipidek mennyiségének befolyásolására az FKBP12 fehérje és az mTOR FRB doménje közti, rapamicin függő heterodimerizációt tervezzük felhasználni olymódon, hogy 1) target szekvenciák beépítésével az FRB domént különféle sejtorganellumok citoplazmatikus felszínéhez irányítjuk; 2) az FKBP fehérjét kapcsoljuk olyan enzimekhez, amelyek képesek az inozitol gyűrűn lévő foszfátcsoportok számának változtatására. A molekulapárok sejtbeli expresszióját követően rapamicin adására létrejön a fehérjék közötti kapcsolat, az adott enzim transzlokálódik a megfelelő membránhoz, minek hatására bekövetkezik az ott lévő lipidek módosítása. A lipid mennyiség változásának követése GFP-hez kötött PH domének felhasználásával lehetséges. Az inozitol lipidek mennyiségének változtatás a továbbiakban lehetővé a különféle sejtfunkciók (például receptor endocitózis, kapacitatív kalcium influx) lipid függésének tanulmányozását.
Munkaterv
1.) Az inozitol lipideket és inozitol foszfátokat módosító enzimek izolálása
A közelmúltban a 4-es típusú 5-foszfatáz alkalmazásával sikerült létrehoznunk egy olyan rendszert, amely alkalmas a plazma membrán foszfolipáz C 1 PH domén segítségével láthatóvá tehető PtdIns(4,5)P2 tartalmának akut eltávolítására élő sejtekben. A módszer alkalmazhatóságát olyan sejtfunkciók gátlásával igazoltuk (pl. kálcium szignál, TrpM8 ionáram, receptor internalizáció), ahol a PI(4,5)P2 szerepe már bizonyított (Várnai et al., JCB, 175:377-382). A munka folytatásaként további enzimeket is szeretnénk alkalmazni, azonban a kezdetekben a már működő, 4-es típusú 5-foszfatázra koncentrálnánk. Tervezzük azonban a főként monofoszfátokat, azon belül is elsősorban a PtdIns(4)P-ot lebontó Sac1 foszfatáz és synaptojanin-1alkalmazását, illetve az 1-es típusú 5-foszfatáz enzim kipróbálását is. Az enzimeket minden esetben az FKBP-hez fúzionáljuk olymódon, hogy aktivitásuk megmaradjon, ugyanakkor a teljes hosszúságú enzimre jellemző esetleges organellum lokalizáció (például a Sac1 foszfatáz esetében ER lokalizáció) megszűnjön.
2.) Az FRB protein különböző intracelluláris kompartmentekbe történő irányítása
Folytatni szeretnénk a fehérje targetálást a különböző organellumok citoplazmatikus felszínéhez. Különösen olyan organellumok jönnek szóba, amelyek esetében az inozitol lipidek szabályozó szerepe már ismert, és ahol az inozitol lipid anyagcsere enzimei megtalálhatók. Ilyen például a Golgi és az endoszóma. A targetálás tervezésénél az eddig is alkalmazott stratégiát követnénk, azaz az adott organellumra jellemző fehérjék minimális lokalizációs szignál szekvenciáját használnánk (a Golgi esetében például a TGN38-as Golgi rezidens fehérje C-terminális target szekvenciát), figyelembe véve azt is, hogy mindez önmagában lehetőleg ne okozzon se morfológiai, se funkcionális változást a sejtben.
3.) A foszfolipid mennyiség változásának mérése
A különféle membránokban bekövetkező lipid mennyiség változás mérésére a korábban kidolgozott lipid kötő doméneket használnánk (Varnai és Balla, BBA, 1761:957-967). A fluoreszcensen jelölt domének rapamicin hatásra bekövetkező, lipid szint változásra utaló mozgását, illetve a hatásért felelős enzim transzlokációját egyrészt konfokális mérésekkel, másrészt fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) vizsgálatokkal követnénk.
4.) Funkcionális vizsgálatok
Gyakorlatilag nincsen olyan sejtfunkció, amiben valamelyik inozitol lipidnek ne tulajdonítanának szerepet, tehát funkcionális vizsgálatokra számos lehetőség adódik. Módszerünk működésének kipróbálására ezek közül elsőként olyanokat szeretnénk vizsgálni, amelyeket már jól ismerünk és rendelkezünk bizonyos tapasztalatokkal. Ilyen például a citoplazmatikus Ca2+ jel kialakulása, illetve az angiotenzin receptor internalizációjának szabályozása. A Ca2+ szignál esetében a kezdeti belső raktárból való Ca2+ ion kiáramláshoz nyilvánvalóan szükséges, hogy az Ins(1,4,5)P3 keletkezéséhez rendelkezésre álljon a PtdIns(4,5)P2 a plazma membránban, a kapacitatív Ca2+ influx aktiválódásának következtében létrejövő fenntartott fázis inozitol lipid függése azonban már egy olyan kérdés, amelyre a kidolgozott molekuláris módszer segítségével kaphatunk választ.
Hasonlóan, az irodalmi adatok tükrében feltételezhetjük, hogy a receptor internalizáció függ a plazma membrán PtdIns(4,5)P2 szintjétől, hiszen a kialakuló fehérjekomplex számos eleme tartalmaz lipid interakcióra képes, funkcionális szempontból is hatásosnak tűnő domént. Azonban a folyamat számos részlete (lipid specificitás, a lipid-protein kölcsönhatások jelentősége, sorrendje) még messze nem ismert. Vizsgálni szeretnénk tehát konfokális mikroszkópiával a receptor internalizációban részt vevő, fluoreszcensen jelölt fehérjék (-arresztin-1, dinamin, AP-2, CALM, epszin) lipid függő transzlokációját; minden esetben rapamicinnel történő kezelést követően. Ezen fehérjék egy része már elkészült, valamint fluoreszcens fehérjével jelölt angiotenzin receptor (AT1), és maga az ugyancsak jelzett angiotenzin-2 is rendelkezésünkre áll. Kísérleteinkhez emlős sejtvonalakat (COS-7, HEK293) tervezünk használni, a megfelelő fehérjéket tranziensen expresszáljuk, esetleg stabil sejtvonalakat készítünk.
Várható eredmények
Reményeink szerint a módszer lehetővé teszi a plazma membránban és más intracelluláris membránban található inozitol lipidek mennyiségének szelektív változtatását, és ilymódon a normál sejtműködésben, illetve patológiás állapotok kialakulásában játszott szerepüknek vizsgálatát.
felvehető hallgatók száma: 3
Jelentkezési határidő: 2024-06-30
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
