témavezető: Bodor Andrea
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
A fehérjék feltekeredésével kapcsolatos betegségek molekuláris hátterének tisztázása molekulaszerkezet meghatározást igényel. A fehérjéknek betegségekkel kapcsolatba hozható konformáció-változásaira az oldatfázisú jellemzés az ideális. Legtöbb esetben a fehérje funkciójának változása összefüggésben áll a normális, illetve kóros folyamatokban felvett másodlagos, harmadlagos, negyedleges szerkezeti formákkal. Ezen állapotok megkülönböztetése és szerkezeti jellemzése a legújabb és leghatékonyabb szerkezetvizsgálati módszerek alkalmazásával is nagy kihívást jelent.
A fehérjék szerkezeti és oldatbeli mozgásainak atomi szintű feltérképezésében az NMR spektroszkópia egyedülálló módszer, mellyel oldatfázisban tanulmányozhatók a fehérjék szerkezete, dinamikája. A jól definiált szerkezettel rendelkező globuláris fehérjék mellett a rendezetlen fehérje szakaszok naszcens másodlagos szerkezeti hajlama is tanulmányozható. Rendezetlen fehérjékben nagy gyakoriságú a prolin aminosav előfordulása, amely a kevésbé stabil cisz izomerként is megjelenhet. A természetben megtalálható aminosavak között a cisz forma ritka (0,03 %), a prolin esetében azonban a cisz előfordulási aránya körülbelül 5 %-os).
A prolin cisz-transz izomerizációja gyakran kulcslépés a fehérjék funkciójának betöltéséhez: előfordulása gyakori Ser/Thr-Pro motívumoknál, ahol posztranszlációs módosulások (foszforiláció) hatására a fontos szerkezeti változások hatására a cisz-konformerek aránya megnő, ezáltal a fehérje szerkezete és biológiai funkciója is megváltozhat. Kutatásaink során NMR módszereket fejlesztünk a prolin konformációjának Cβ, Cγ kémiai eltolódás alapján történő meghatározására. Vizsgált rendszerünk, a 60 aminosav hosszú p53 tumorszuppresszor transzaktivációs doménje 10 db prolint tartalmaz.
A rendezetlen fehérjék mellett jól-definiált 3D szerkezettel rendelkező globuláris fehérjék vizsgálatát végezzük különböző NMR módszerekkel: szerin proteáz inhibitorok (SPINK1 és SGCI) esetén a különböző mutációk hatását a szerkezetre és a dinamikára (SSP, T1, T2, hetnoe).
A peptid- és fehérjealapú hatóanyagok becsomagolására alkalmas legelterjedtebb, leghatékonyabb, természetes nanorendszer a lipid kettősréteg, melynek konkrét formája a bicella. A bicella kiváló modellrendszer, amellyel a kettősrétegből felépülő hatékony nanohordozók, a vezikulák valamint a modellmembrán fehérjék lipidkörnyezete és kölcsönhatásai tanulmányozhatóak.
Adott fehérje különféle módon tudja megváltoztatni a bicella alakját, illetve a membrán görbületét, ami a hatóanyag felszívódását is befolyásolhatja. Mindezek tükrében belátható, hogy a fehérjék alakjának, tömörségének, illetve a membránok (bicellák) görbületének fiziko-kémiai jellemzése nagy jelentőségű, hiszen igen gyakran a laboratóriumi in vitro modellrendszerek szolgálnak a komplexebb, nagyobb horderejű vizsgálatok alapjául.
Mindezek tükrében belátható, hogy a fehérjék alakjának, tömörségének, illetve a membránok (bicellák) görbületének fiziko-kémiai jellemzése nagy jelentőségű, hiszen igen gyakran a laboratóriumi in vitro modellrendszerek szolgálnak a komplexebb, nagyobb horderejű vizsgálatok alapjául.
A kérdés tanulmányozásához szükséges legjobb módszerek közé tartozik az NMR spektroszkópia és a SAXS technika ötvözete, mivel mindkettő biológiailag releváns környezetben szolgáltat információt, így olyan szerkezeti biológiában hasznos paramétereket határozhatunk meg, mint a fehérjék alaktényezője és kompaktsági faktora. Ehhez rendezett, denaturált és membránfehérje alaptípusokat használunk. Oldatfázisú NMR vizsgálatokból adott fehérjére megmért D transzlációs diffúziós együttható értékéből meghatározzuk a hidrodinamikai sugarat (RH). Pontosan ugyanebből az oldatból SAXS méréssel az RG girációs sugár és a fehérje alakja (durvaszemcsés közelítéssel) is megadható. Párhuzamosan a denaturáló közegben elvégzett mérések egy kompaktsági faktor meghatározását is lehetővé teszik.
NMR-SAXS módszerek ötvözetével (Dudás, Wacha, Bóta, Bodor munkája nyomán) biológiailag releváns fehérje fragmensek bicellákkal történő kölcsönhatását vizsgáljuk. Ezen vizsgálatok a rendszer globális (rH, rG) és lokális (adott kémiai környezet) paramétereinek meghatározására irányulnak. Követjük a lipid és a peptid oldaláról történő változásokat.
teszik.
A kompaktsági faktor a fehérjék szerkezetén túl azok biológiai folyamatokhoz köthető viselkedésének fokmérője. A kompaktságot befolyásolja a fehérje oldószer által elérhető felülete, valamint alakja. Az oldószer által elérhető felület számolható, az alak jellemzésére a girációs (RG) és hidrodinamikai (RH) sugarak hányadosával értelmezett alaktényező szolgál. Jelenleg erre az arányra az irodalom a 0.77 (gömb), 0.8 (nyújtott), 1.77 (fonál) értékeket közli. Számos fehérje esetében a különféle adatbázisokban már rendelkezésre álló adatok hiányosak, vagy pedig a megadott értékek eltérő mérési körülményekre vonatkoznak, ezért az összehasonlítások nehézkesek, a levonható következtetések – előméréseink tanúsága szerint – nem helytállóak. E tények mutatják, hogy az alaktényező szisztematikus meghatározására nagy szükség van. Az ELTE 700MHz NMR laboratóriuma és az MTA TTK-ban épített „state-of-the-art” szintű SAXS nagyberendezés (Bóta Attila kutatócsoportja) szomszédos épületekben van, így az együttműködés során nagy precizitású adatokat helyben tudunk meghatározni. Ezen felül a tény, hogy a mérések ugyanazon mintán elvégezhetőek egy egyedülálló lehetőséget biztosít.
A fehérje/hordozó rendszerek kapcsán terveink között szerepel a bicellák és fehérjék kölcsönhatásainak tanulmányozása. Az irodalomban a hidrodinamikai sugár hőmérséklet, vagy fehérje kötődés okozta növekedését a bicella méretváltozásával hozzák összefüggésbe, holott ezt az alak változása is okozhatja. A fentiek tükrében azt kívánjuk megvizsgálni, hogyan változik a semleges (DHPC/DMPC) és negatív töltésű (DHPC/DMPC+DMPG) bicellák mérete és alakja transzmembrán, illetve felülethez kötődő fehérje esetében. Kísérleteinkhez a két topológiailag különböző esetet alkalmazzuk: a transzmembrán KALP23 szintetikus fehérjét, a felülethez kötődő dinorfin DYNA és a melittin peptideket használjuk. Eredményeink a membrán-mimetikumok viselkedésének és kötődés hatására történő változásaik tanulmányozásában előrelépést jelentenek. Ugyanakkor sikeresen alkalmazhatókká válnak a szerkezeti biológiában, például egy konkrét biológiai rendszerre vonatkozó következtetések is levonhatóak lesznek. Ezt tesztelni kívánjuk az S100A4 fehérje és ERD14 dehydidrin fragmensekre is.
Jelentkezési határidő: 2022-10-15
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
