Bejelentkezés
 Fórum
 
 
Témakiírás
 
NADPH oxidáz enzimek által termelt reaktív oxigén származékok szerepe jelátviteli folyamatokban, redox fehérje módosítási reakciókban.

TÉMAKIÍRÁS

Intézmény: Semmelweis Egyetem
elméleti orvostudományok
Molekuláris orvostudományok Doktori Iskola

témavezető: Sirokmány Gábor
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem, Élettani Intézet
helyszín rövidítés: SE


A kutatási téma leírása:

Bevezetés, eddigi megfigyeléseink
A NADPH oxidázok családjába tartozó enzimek (Nox1-5, Duox1 és Duox2) olyan membránfehérjék, melyek reaktív oxigén származékokat (ROS), szuperoxid aniont és hidrogén peroxidot képesek előállítani (1). A Duox enzim igen konzervált fehérje, amely már a Caenorhabditis elegans fonálféregben is termelődik. Munkacsoportunk több más korábbi megfigyeléssel összhangban kimutatta, hogy humán keratinocitákban sejten belüli Ca++-jel hatására aktiválódik a Duox1 és elsőként írtuk le, hogy az epidermális növekedési faktor (EGF) hatására termelődő hidrogén peroxid forrása a Duox1 fehérje, amely az EGF által kiváltott sejten belüli Ca++-szint emelkedés hatására aktiválódik (2). Kérdésünk, hogy mi lehet a Duox1 hidrogén peroxid termelésének a biológiai szerepe, milyen keratinocita funkciókat érinthet, valamint az, hogy emlős állatok és az ember bőrében mi a szerepe a különböző ingerek által kiváltott Ca++-jelnek és ezen keresztüli Duox1 serkentésnek.

Célkitűzés
Vad típusú és Duox1 hiányos egerek válaszait kívánjuk összevetni különböző felületes, bőrt érintő fájdalomingerekre. Vizsgálni kívánjuk a nociceptív stimulusnak megfelelő gerincvelői szelvények neuronjaiban létrejövő jelátviteli változások intenzitását (c-fos, c-jun expresszió alakulása). Meg akarjuk határozni, hogy a keratinocitákból felszabaduló hidrogén peroxid hogyan befolyásolja hátsó gyöki idegsejtek nyugalmi membránpotenciál értékeit. Vad típusú és Duox1 hiányos egerek szöveteinek elemzésével azonosítani kívánjuk a bőr epidermis rétegében különböző nociceptív stimulusok hatására létrejövő redox fehérje módosulásokat. Duox1 specifikus ellenanyagot kívánunk létrehozni, különböző rekombináns fehérjeként termelt Duox1 domének elleni immunizáció révén. Ennek segítségével kívánjuk feltárni a Duox1 sejten belüli és szöveti eloszlását illetve ennek dinamikáját a bőrt érő külső ingerek hatására.

Módszertan
Munkacsoportunk rendelkezésére állnak Duox1 hiányos, illetve vad típusú egértörzsek C57Bl/6 genetikai háttérrel. Sejtkultúrában rendelkezünk epidermális eredetű A431 tumoros sejtvonallal illetve immortalizált humán HaCaT keratinocita vonallal. A nociceptív válaszokra adott viselkedési válaszokat a Pécsi Tudományegyetem Farmakológia és Farmakoterápiai Intézetében Helyes Zsuzsanna munkacsoportjával együttműködésben tervezzük vizsgálni. A gerincvelő szövettani vizsgálatához a Semmelweis Egyetem Élettani Intézete rendelkezik a paraffin blokkok és metszetek készítéséhez szükséges összes berendezéssel. Izolált primer hátsó gyöki idegsejtek (DRG) tenyészetén kívánjuk fluoreszcens membránpotenciál- illetve kálciumérzékeny anyagokkal vizsgálni a hidrogén peroxid hatását a DRG sejtek nyugalmi membránpotenciáljára illetve Ca++ jeleire. A redox fehérje módosulások tömegspektrometriai elemzéséhez Nagy Péter munkacsoportjával folytatnánk korábbi együttműködésünket az Onkológiai Intézet Molekuláris Immunológia és Toxikológia Osztályán. A Duox1 ellenes antitestek fejlesztéséhez Duox1 hiányos egereket Drosophila S2 sejtekben termelt és onnan izolált Duox1 doménekkel fogunk immunizálni Freund adjuváns segítségével. A poliklonális egérszérumok immunreaktivitását és specificitását vad típusú és Duox1 hiányos egérszövetekből készített szövetlizátumok segítségével ellenőrizzük western bloton. Pozitív immunreakció esetén az egerek levéreztetése után azok lépsejtjeit is izoláljuk monoklonális ellenanyag termelés további céljával.

Összefoglalás
Kísérleteinkkel szeretnénk feltárni azon biokémiai és biológiai funkciókat, amiben a Duox1 enzim a keratinocitákban részt vesz. A fent leírt megközelítésekkel meghatározzuk a Duox1 termelte hidrogén peroxid által szabályozott fehérjéket, illetve azonosítjuk ezen fehérjék szerepét a bőr szenzoros, nociceptív funkcióiban. Ezáltal nem csupán a Duox1 eddig nagyrészt ismeretlen élettani szerepét érthetjük meg jobban, hanem a bőr gyulladásos, regenerációs folyamatainak befolyásolásához is új molekuláris célpontokat tárhatunk fel.

Irodalomjegyzék:
1. Sirokmány G, Donkó Á, Geiszt M. Nox/Duox Family of NADPH Oxidases: Lessons from Knockout Mouse Models. Trends Pharmacol Sci. 2016 Apr;37(4):318-27.
2. Sirokmány G, Pató A, Zana M, Donkó Á, Bíró A, Nagy P, Geiszt M. Epidermal growth factor-induced hydrogen peroxide production is mediated by dual oxidase 1. Free Radic Biol Med. 2016 Aug;97:204-11.
3. Donkó A, Ruisanchez E, Orient A, Enyedi B, Kapui R, Péterfi Z, de Deken X, Benyó Z, Geiszt M. Urothelial cells produce hydrogen peroxide through the activation of Duox1. Free Radic Biol Med. 2010 Dec 15;49(12):2040-8.


Jelentkezési határidő: 2020-10-17


2020. X. 20.
ODT online ülés
Az ODT következő, online ülésére 2020. november 6-án 10.00 órakor kerül sor.

 
Minden jog fenntartva © 2007, Országos Doktori Tanács - a doktori adatbázis nyilvántartási száma az adatvédelmi biztosnál: 02003/0001. Program verzió: 2.2358 ( 2017. X. 31. )