témavezető: Csanády László
helyszín (magyar oldal): SE Orvosi Biokémiai Intézet helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
1. Bevezetés
Agyi ischaemiát követő reperfúzió oxidatív stresszt idéz elő az idegsejtekben. Az oxidatív károsodás miatti sejthalált az intracelluláris [Ca2+] nagymértékű, irreverzibilis megemelkedése előzi meg (delayed Ca2+ deregulation, DCD). Ez a stroke-ot követő korai reakció új terápiás beavatkozások fontos célpontja lehetne. A DCD kialakulásában fontosak a sejtmembrán TrpM2 ioncsatornái 1, amelyek az oxidatív stresszre igen érzékeny striatalis neuronokban is jelen vannak 2,3. Ezeket a Ca2+-ra is permeábilis nem-szelektív kationcsatornákat a NAD-bomlástermék ADP-ribóz (ADPR) aktiválja (ez valószínűleg a mitochondriumból szabadul fel), de ciklikus ADPR (cADPR), AMP, Ca2+, és H2O2 is befolyásolják 4-6. A TrpM2 C-terminális doménje aktív ADPR-pirofoszfatáz (ADPRáz) 7. Az eddigi tanulmányok a teljes sejtfelszín makroszkópos áramainak mérésén (whole-cell patch-clamp) alapultak, ezért a rendelkezésre álló információ zöme indirekt, és a molekuláris mechanizmusokról keveset tudunk.
2. Célkitűzés
Kutatásaink révén arra szeretnénk választ kapni, milyen molekuláris mechanizmussal szabályozza a ligandok (ADPR, cADPR, Ca2+, H2O2) bekötődése, valamint a TrpM2 saját enzimatikus aktivitása, a csatorna pórus kapuzását.
3. Előzetes eredmények
Az Intézetben működő Neurobiokémia munkacsoport hosszú évekre visszamenő tapasztalatokkal bír az oxidatív sejtkárosodás területén (ld. 1), e téren szorosan együttműködésre számíthatunk. Saját Ioncsatorna kutatócsoportunk részletesen tanulmányozta az agyi kapilláris endothel sejtek TrpM2-vel rokon Ca2+ és ATP-függő nem-szelektív kationcsatornájának (CA-NSC) kapuzását 9,11, valamint a szintén enzimatikus aktivitással bíró és ATP-függő CFTR klorid csatorna kapuzását, szerkezetét (pl. 12) és termodinamikáját 13.
A tervezett kísérleti módszerek kivitelezéséhez többéves tapasztalattal rendelkezünk 11-13. Az egyedi ioncsatorna áramok elemzését, értelmezését lehetővé tevő elméleti módszerek fejlesztéséhez magunk is hozzájárultunk 8-10, saját fejlesztésű szoftvereink jelentősen megkönnyítik e munkát.
4. A kutatás módszere
A rekombináns humán (vad típusú és mutáns) TrpM2 fehérjét Xenopus laevis (afrikai karmosbéka) petesejtjeiben kifejezve vizsgáljuk. E csatornák cDNS-ét plazmidba inzertálva E. coli-ban szaporítjuk. In vitro transzkripciót követően tisztított cRNS-t injektálunk az oocytákba. Az egyedi csatornák kapuzását a patch-clamp technika inside-out (i/o) konfigurációjában regisztráljuk, miközben citoplazmatikus felszínüket tetszőleges összetételű és hőmérékletű oldattal közvetlenül perfundáljuk 13. A patkány és humán TrpM2 C-terminális enzimatikus doménjét (NUDT9-H) hisztidin-tag-et tartalmazó plazmidba klónozzuk, a fehérjét E. coli-ban termeljük és Ni-NTA oszlopon tisztítjuk. Az ADPRáz aktivitást a keletkező AMP-ből és ribóz-5-P-ból alkalikus foszfatázzal felszabadítható inorganikus foszfát mérésével számszerűsítjük 7.
5. Megválaszolandó kérdések
5.1. ADPR aktiváló hatásának mechanizmusa
5.1.1. Az ADPR kötődése a TrpM2 C-terminális intracelluláris doménjéhez (NUDT9-H) ismeretlen mechanizmussal aktiválja a csatorna pórusát 7. Az aktivációra egyszerű magyarázatot nyújthat egy olyan modell, amelyben a pórus megnyílásakor a kötőhely maga is konformációváltozást szenved. Amennyiben a pórus nyitott állapotában a ligandkötőhely erősebben köti az ADPR-t mint csukott állapotban, akkor a mikroszkopikus reverzibilitás értelmében a ligand bekötődése viszont a pórus nyitott állapotát fogja stabilizálni. Ilyen módon aktiválja a dekavanatát (és gátolják a nukleotidok) az agyi endothelsejtek CA-NSC csatornáit 9. Az egyedi csatornák meghatározandó átlagos (steady-state) nyitva- és csukvatartási idejének eltérő [ADPR]-függése bizonyítaná 9, ennek hiánya cáfolná, ezt a feltételezett egyszerű mechanizmust. A csatorna enzimatikus aktivitása megnehezítené e mérések értelmezését, ezért ezeket a működő, ADPR-zal stimulálható 4, de katalitikusan inaktív 14 Q1408K/E1409K aktív-hely mutáns csatornán fogjuk végezni.
5.1.2. Az ADPR hidrolízisének szerepe ismeretlen. E hidrolízis sebessége ≈0.1 s-1, kb. 100-szor lassabb mint a NUDT9-H doménnel homológ mitochondriális NUDT9 ADPRáz enzimé (≈8 s-1) 7. Lehet, hogy a TrpM2 lassú ADPRáz aktivitása a G-fehérjék α-alegységének GTP-áz aktivitásához hasonló időzítő mechanizmus, amely átmeneti (kb. 10 s) aktív periódus után inaktiválja a csatornát. Ha ez igaz, akkor az ADPR hirtelen megvonását követően a csatornák átlagos inaktivációs sebessége az ADPRáz aktivitás sebességét kell tükrözze. A béka-petesejtbe injektált [RNS] növelésével nagyszámú csatorna is expresszálható (akár >1000/patch 12), így i/o patch-ben a citoszolikus felszínt ADPR-zal közvetlenül perfundálva makroszkópos TrpM2 áramot is aktiválhatunk. Az ADPR hirtelen elvonását követő inaktiváció sebessége így könnyen meghatározható 12,13, és összevethető a tisztított NUDT9-H domén enzimatikus aktivitásának sebességével. Az inaktiváció sebessége és az ADPRáz aktivitás között fennálló esetleges korreláció keresésére a következő kondíciókat fogjuk összevetni: (i) humán és patkány vadtípusú csatorna, (ii) vadtípusú és katalitikusan inaktív Q1408K/E1409K csatorna, (iii) alacsony és magas [Mg2+] (az enzimaktivitás Mg2+-függő), (iv) pH=7.1 és 8.5 (az enzim pH optimuma bázikus 14), (v) T=25oC és 15oC (a kísérlet többször megismételhető ugyanazon patch-ben különböző hőmérsékleteken). (vi) Megkísérelünk előállítani egy hiperaktív mutánst (az I1405E mutáció helyreállítana egy, a TrpM2-ből hiányzó, az aktívabb NUDT9 enzim katalízisében viszont fontos szerepet játszó, glutamátot), vagy TrpM2/NUDT9 chimérát is.
5.2. cADPR és AMP moduláló szerepe
Bár a cADPR önmagában nem aktiválja a TrpM2 csatornát, intakt sejtben cADPR jelenléte több mint két nagyságrenddel megnövelte a csatorna látszólagos érzékenységét az aktiváló ADPR iránt 5. Egyelőre nem ismert, hogy a cADPR a sejt metabolizmusának megváltoztatásával (az i.c. [ADPR] és/vagy [Ca2+] megemelésével), vagy pedig közvetlenül a TrpM2 csatornához kötődve fejti ki e hatását. I/o patch-ben, a csatornákat közvetlenül perfundálva ADPR, cADPR, és ADPR+cADPR tartalmú oldatokkal fogjuk megvizsgálni ezt a kérdést.
Intakt sejtben az [AMP] emelkedése gátolja a TrpM2 ADPR által történő aktiválódását 5. Az AMP, mint az ADPR egyik hasítási terméke, elvileg kötődhet a TrpM2-re specifikus C-terminális NUDT9-H domén ADPR kötőhelyéhez, az aktiváló ADPR-zal kompetálva. Az AMP azonban nagy affinitással gátolja a TrpM4 csatornát is 15 (vö. 9), ezért az is lehet, hogy a TrpM család minden tagjában megtalálható nagy N-terminális doménhez ("TrpM homology region") kötődve gátol (nem-kompetitív gátlás). I/o patch-ben, különböző [ADPR] és [AMP] közvetlen perfúziójával, meg fogjuk vizsgálni, hogy az AMP az ADPR maximális hatékonyságát (nem-kompetitív gátlás), vagy látszólagos affinitását csökkenti (kompetíció; ekkor az AMP hatása nagy [ADPR]-val felfüggeszthető).
5.3. Intracelluláris Ca2+ szerepe
A TrpM2 csak akkor aktiválható, ha Ca2+ kapcsolódik egy i.c. kötőhelyhez a csatorna közvetlen közelében. Mivel a TrpM2 maga is Ca2+-permeábilis, a póruson beáramló Ca2+ pozitív feedback szerepet tölt be 6. Nem tudni, hogy a Ca2+ magához a csatornához, vagy a csatornához asszociálódó más fehérjéhez kötődik-e (pl. calmodulin, vö. TrpM4 16). I/o patch-ben meg fogjuk vizsgálni a calmodulin-gátlószer calmidazolium hatását, valamint azt, hogy a sejtből történő kiszakítást követő fokozatos aktivitásvesztés 3 visszafordítható-e exogén calmodulin perfúziójával.
5.4. Oxidatív stressz okozta aktiváció
A TrpM2 kórélettani jelentősége, hogy oxidatív stressz (pl. intakt sejtek H2O2-vel történő perfúziója) hatására aktiválódik 4,5,17 − a mechanizmus azonban ellentmondásos. Felvetődött, hogy a H2O2 közvetlenül aktiválja a csatornát 17 vagy növeli annak ADPR iránti érzékenységét 5, ill., hogy az oxidatív stressz ADPR-t szabadít fel a mitochondriumból 4. Az intakt sejteken végzett kísérletek csak indirekt bizonyítékokat szolgáltattak, ezért i/o patch-ben fogjuk megvizsgálni a H2O2, ADPR, és H2O2+ADPR tartalmú oldatok közvetlen perfúziójának hatását a TrpM2 kapuzására.
felvehető hallgatók száma: 3
Jelentkezési határidő: 2019-11-05
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
