témavezető: Veress György
helyszín (magyar oldal): DE ÁOK Orvosi Mikrobiológiai Inétzet helyszín rövidítés: OMI
A kutatási téma leírása:
Összefoglalás
Az onkogén humán papillomavírusok (HPV) a méhnyakrák legfontosabb okozói. A HPV E6 és E7 proteinek felelősek a vírus sejttranszformáló aktivitásáért: az E6 a p53, az E7 pedig az Rb (retinoblasztóma) tumor szuppresszor fehérjét képes inaktiválni. A magas kockázatú (onkogén) HPV típusokon belül megkülönböztetünk ún. intratípusos (típuson belüli) variánsokat. Bizonyos HPV típusok esetén (pl. HPV 16 és 18) kimutatták, hogy a különböző intratípusos variánsok egymástól eltérő onkogenitással rendelkeznek. Munkánk során vizsgáljuk a klinikai mintákból izolált egyes magas kockázatú HPV típusok (HPV 31, 33 stb.) E6 és E7 onkoproteinjeinek variabilitását, illetve az egyes izolált variánsokat funkcionális elemzésnek vetjük alá. Többek között vizsgáljuk az E6 variánsok hatását a p53 fehérje stabilitására, illetve funkcionális aktivitására, valamint az E7 variánsok hatását az E2F celluláris transzkripciós faktor aktivitására. Emellett, vizsgáljuk az E6 variánsok fehérje-fehérje interakcióit különböző celluláris proteinekkel (pl. E6-AP). Eredményeink segíthetnek olyan további mechanizmusok feltárásában, amelyek felelősek lehetnek a papillomavírusok onkogén hatásáért. Ezen túlmenően, segíthetnek olyan molekuláris markerek felkutatásában, amelyek hasznosak lehetnek a HPV asszociált malignus és premalignus betegségek diagnosztikájában, ill. prognosztikájában.
Munkaterv
Első lépésben megvizsgáljuk egyes magas kockázatú HPV típusok (pl. HPV 31 és 33) kritikus szakaszaiban, a szabályozó régióban (LCR) és a virális onkogénekben (E6 és E7) jelentkező szekvencia variabilitást. A vírusgenom egyes szakaszait polimeráz láncreakció (PCR) segítségével amplifikáljuk, majd a különböző variánsokat szekvenáljuk.
A variáns LCR szakaszokat ezután luciferáz riporter vektorba klónozzuk, szekvenáljuk és a szekvenciákat összevetjük a már ismert variánsokkal. A riporter vektorokat különböző sejtvonalakba transzfektáljuk, majd transzkripciós aktivitásukat luciferáz teszt alkalmazásával vizsgáljuk. Amennyiben találunk funkcionális különbségeket az egyes promoter variánsok között, akkor – in vitro mutagenezis alkalmazásával - megkíséreljük meghatározni azokat a nukleotid változásokat, amelyek felelősek a funkcionális különbségekért.
Ezek után a virális E6 és E7 onkogének szekvencia variabilitásának funkcionális jelentőségét vizsgáljuk. A variánsokat szekvenáljuk, majd expressziós vektorba klónozzuk. Vizsgáljuk az E6 variánsok hatását a p53 celluláris tumor szuppresszor fehérje stabilitására. E célból, MCF-7 sejteket stabilan transzfektálunk a különböző E6 variánsokat expresszáló plazmidokkal, majd Western blot segítségével vizsgáljuk az endogén p53 fehérje szintjét a transzfektált sejtekben. Hasonló módszerekkel vizsgáljuk az E7 variánsok hatását a celluláris pRb fehérje stabilitására.
Tranziens kotranszfekciós kísérletekben vizsgáljuk az onkogén variánsok hatását a fent említett celluláris tumor szupresszor géntermékek (p53, ill. pRB) funkcionális aktivitására. Ehhez különböző sejtvonalakba transzfektáljuk az onkogén variánsokat tartalmazó expressziós vektorokat, ill. a celluláris géntermékek aktivitását jelző luciferáz riporter vektorokat, majd luciferáz teszt segítségével mérjük a riporter konstruktok transzkripciós aktivitását. Ezzel a módszerrel tanulmányozzuk az E6 variánsok hatását a p53 fehérje funkcionális aktivitására. Ehhez, az E6 variánsokat tartalmazó expressziós vektorokat olyan riporter vektorokkal együtt transzfaktáljuk MCF-7 sejtekbe, amelyek több kópiában tartalmazzák a p53 felismerési szekvenciáját ( a p53 fehérje ugyanis transzkripciós faktorként is funkcionál). Másrészről, vizsgáljuk a HPV E7 variánsok hatását a pRb fehérje funkcionális aktivitására. Ehhez, az E7 variánsokat tartalmazó expressziós vektorokat olyan riporter vektorokkal együtt transzfaktáljuk MCF-7 sejtekbe, amelyek több kópiában tartalmazzák a E2F transzkripciós faktor felismerési szekvenciáját. Itt azt használjuk ki, hogy a HPV E7 fehérje – kötődve az Rb-E2F komplexekhez – képes felszabadítani a komplexből az E2F transzkripciós faktorokat, melyek aktivitását ezután megfelelő riporter vektorokkal (amelyek a E2F transzkripciós faktor felismerési szekvenciáit tartalmazzák) könnyen ki lehet mutatni.
Ismert, hogy a HPV onkogének (részben a p53, ill. a pRb fehérjén keresztül, részben azoktól függetlenül) képesek befolyásolni számos fontos celluláris gén expresszióját. Például, a HPV 16 E6 onkogén nagy mértékben fokozza a telomeráz reverz transzkriptáz gén (hTERT) transzkripciós aktivitását. Tranziens transzfekciós kísérletekben vizsgáljuk az onkogén variánsok hatását egyes celluláris gének (pl. az említett hTERT) transzkripciós aktivitására. Ehhez különböző sejtvonalakba transzfektáljuk az onkogén variánsokat tartalmazó expressziós vektorokat, ill. a celluláris gének promotereit tartalmazó luciferáz riporter vektorokat, majd luciferáz teszt segítségével mérjük a promoterek transzkripciós aktivitását.
Ko-immunoprecipitációs módszerrel tervezzük vizsgálni az E6 variánsok in vitro fehérje-fehérje interakcióit különböző celluláris proteinekkel (pl. E6-AP). E célból az E6 variánsokat bakteriális expressziós vektorba klónozzuk, GST „farokkal” jelöljük, majd reagáltatjuk a celluláris fehérjékkel. Ezután, az E6-celluláris fehérje komplexeket anti-GST ellenanyag tartalmú oszlopon tisztítjuk, eluáljuk, majd az eluátumból Western blot módszerrel mutatjuk ki az adott celluláris fehérjét (pl. E6-AP), a megfelelő specifikus ellenanyagok felhasználásával.
felvehető hallgatók száma: 1
Jelentkezési határidő: 2018-05-15
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
