témavezető: Hegedűs Tamás
helyszín (magyar oldal): Biofizikai Intézet helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
Az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék fontos szerepet töltenek be minden élő szervezetben. Többségük aktív transzporterként, ATP felhasználásával különféle anyagokat (pl. lipidek, hormonok, immunogén peptidek, stb.) juttat keresztül a sejtmembránon. A normálistól eltérő expressziós szintjük vagy működésük különféle betegségekben játszik szerepet, mint amilyen például a cisztás fibrózis, multidrog-rezisztencia, II. típusú cukorbetegség, familiáris krónikus intrahepaticus cholestasis, Dubin-Johnson szindróma, adrenoleukodisztrófia, szitoszterolémia. Cisztás fibrózisban, amely a leggyakoribb öröklődő betegség a fehér populációban, a CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) elnevezésű ABC fehérje génje hibás. A CFTR mutációi károsan befolyásolják ennek a klorid csatornának az expresszióját és működését, ami miatt a hámszövetek víz- és sóháztartása felborul. Az ABC fehérjék közül több alacsony szubsztrát specificitással rendelkezik, ezért igen eltérő kémiai szerkezetű mérgező anyagokat tudnak a sejtekből eltávolítani. Ezek a multidrog-transzporterek (pl. MDR1, MRP1, és ABCG2) megakadályozzák gyógyszerek (pl. antidepresszánsok és rákellenes kemoterápiás anyagok) felszívódását és célba jutását.
E betegségek miatt a tudományterület fő célkitűzése olyan vegyületek kifejlesztése, amelyekkel specifikusan befolyásolható ABC fehérjék működése. Az eddig kifejlesztett vegyületek többsége hidrofób anyag, amelyek képesek áthatolni a sejtmembránon, és a sejtmembránban magában vagy a sejten belüli térben fejtik ki hatásukat. Alkalmazhatóságuknak egyik korlátja éppen az ABC családba tartozó multidrogtranszporterek, amelyek eltávolítják a sejtből ezeket a zsíroldékony vegyületeket, koncentrációjukat a hatékony szint alá csökkentve. Ezért azt tűztük ki célul, hogy a CFTR és az ABCG2 fehérje hosszabb extracelluláris hurokjainak szerkezeti tanulmányozásával megteremtsük az alapjait olyan vízoldékony vegyületek tervezésének, amelyek az ABC fehérjék működését a sejten kívüli térből képesek
megváltoztatni a fehérje extracelluláris hurokjaihoz kötődve. Ennek több racionális alapja is van: (1) Bakteriális importerek esetén a transzportot a szubsztrát és a kötő-fehérje komplexének az ABC alegység extracelluláris hurokjaihoz való kötődése indítja be. (2) Több olyan monoklonális, ABC fehérjét felismerő antitestet is létrehoztak, amelyek extracelluláris hurkokhoz kötődnek, a transzporter konformációjától függő módon, s amelyek kötődése a transzporter funkcióját befolyásolja. (3) A CFTR extracelluláris hurokjaiban lokalizált, betegséget okozó mutációk a csatorna működését teszik tönkre.
Specifikus célkitűzések és alkalmazott módszerek:
1. A CFTR és ABCG2 fehérje hosszabb extracelluláris hurokjának tanulmányozása. A teljes fehérje szerkezetének meghatározása rendkívüli nehézségekbe ütközik. Ezért vad típusú és olyan izolált extracelluláris hurkok szerekezetét és dinamikáját jellemezzük kísérletes és elméleti módszerekkel, amelyek mutációkat hordozva növelik vagy csökkentik a fehérje működését. A külső hurkoknak megfelelő peptidet bakteriumban termeltetjük, majd tisztítjuk. Az NMR kísérletekhez a megfelelő körülményeket (hőmérséklet, pH, PMF- és sókoncentráció) CD spektroszkópia segítségével állítjuk be. A peptidek 15N és 15N,13C jelölését is elvégezzük, hogyha a peptidek flexibilitása miatt a szerkezetmeghatározáshoz az NMR spektroszkópia nem biztosít elegendő NOE kényszerfeltételt, akkor a kémiai eltolódások és a relaxációs idők felhasználhatók legyenek a peptidek dinamikájának jellemzésére. Az NMR adatoknak megfelelő konformereket a „Sample and Select” elméleti módszerrel határozzuk meg.
Az eredmények a vad-típusú és a mutáns hurkokról olyan strukturális és dinamikai adatokat fognak szolgáltatni, amelyek nélkülözhetetlenek a jövőbeli gyógyszer-tervezéshez és az ABC fehérjék működésének jobb megértéséhez.
2. A hosszabb extracelluláris hurkok szerkezeti szerepének meghatározása a teljes hosszúságú fehérjékben. Az extracelluláris hurkokban található mutációknak a transzmembrán helixek konformációjára gyakorolt hatását az intakt fehérjében is megvizsgáljuk cisztein keresztkötést alkalmazva. Ehhez olyan mutánsokat készítünk, amelyeket a CFTR és az ABCG2 cisztein nélküli konstrukciójából származtatunk két cisztein egy-egy transzmembrán helixbe történő visszahelyezésével. Az hurok-mutációknak a helixek közötti távolságra gyakorolt hatását a molekuláris vonalzóként működő, eltérő méretű keresztkötő reagensekkel határozzuk meg. A keresztkötés Western blot-val észlelhető, ugyanis a keresztkötött fehérjék látszólagos molekulatömege SDS-gélben megnövekszik.
Ezek a kísérletek nem szolgáltatnak atomi felbontású információt a bekövetkező szerkezeti változásokról, ezért azokat molekuláris dinamikát használva modellezzük. Annak érdekében, hogy ennek a nagy rendszernek (ABC fehérje és membrán kettősréteg) az MD szimulációja biológiailag releváns időskálát fedjen le, egyszerűsített fehérje/lipid modellt használunk.
Az extracelluláris hurkok és a kapcsolódó transzmembrán hélixek konformációjának és dinamikájának ismerete - működő és nem működő fehérjékben - megalapozza olyan vegyületek racionális tervezését, amelyek alkalmasak lesznek a CFTR, az ABCG2 fehérje és potenciálisan más ABC transzporter működését stimulálni (pl. CFTR esetében) vagy gátolni (pl. multidrog-transzporterek esetében).
felvehető hallgatók száma: 3
Jelentkezési határidő: 2018-05-30
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Bejelentkezés
