 |
|
| Témakiírás |
| |
A kutatási téma leírása:
1. A betegségre való hajlamosító gének keresésére a humán genomban három alapvető módszert lehet megkülönböztetni: (I) Teljes, illetve parciális genomszűrés, ezen belül megkülönböztethetünk mikroszatellita és SNP analízist; (II) jelölt gén analízis; és (III) microarray génexpressziós vizsgálatok. A publikált teljes genomszűréseknél a mikroszatellita analízist használták. Eddig 16 teljes genomszűrést publikáltak asztmás, vagy asztmához kapcsolódó fenotípusokra 12 különböző populációban . Az asztma genetikai komplexitására utal, hogy 20 különböző genomterületen találtak asztmára hajlamosító géneket. Mivel ezek a genomterületek általában 10-20 millió bázispár nagyságúak, egyenként több száz jelölt gént is tartalmazhatnak. A következő feladat ezeknek az óriási genomterületeknek a szűkítése, a felbontás javítása sűrűn elhelyezkedő SNP-kel, például a leginkább az ilyen feladatokra alkalmas nagyteljesítményű GenomeLab SNPstream Genotipizáló készülékkel. Eddig a jelölt genomrégiók közül 4-ben sikerült SNP-k felhasználásával, pozícionális klónozással az asszociációért felelős gént, illetve genetikai variációkat azonosítani. Ennek jelentőségét mutatja, hogy az így azonosított géntermékek egy részére már folynak is a vizsgálatok, hogy alkalmasak-e gyógyszercélpontnak.
Az általunk az első vizsgálni kívánt genomrégió, a minden genomszűrésben detektált 11q13, amelyen eddig még nem sikerült megtalálni az asszociációért felelős gént, illetve genetikai variációt. Már 1989-ben találtak mikroszatellita markerrel kapcsoltságot a 11q13 és az atópia között. Később a nagy affinitású IgE receptor β láncának (FcεRI-β) génjét lokalizálták erre a régióra. Ez a receptor az elsődleges effektor az IgE azonnali hiperszenzitivitást okozó hatásában. A genetikai kapcsoltság és az atópiával való asszociáció erős anyai hatást mutat, azaz a betegség akkor öröklődik együtt az alléllal, ha a gyermek az anyától kapja.
Az FcεRI-β génben található polimorfizmust összefüggésbe hozták atópiával, asztmával, bronchialis hiperreaktivitással és súlyos atópiás dermatitissel. Mindezek ellenére a talált Ile181Leu polimorfizmus jelentősége erősen vitatott. Egyrészt funkcionálisan semmilyen változást nem okoz a receptor működésében, másrészt több tanulmányban egyáltalán nem találták meg. Ezek közé tartozik az általunk vizsgált magyar populáció is, amelyben sem asztmásokban, sem egyéb allergiás betegségben szenvedőkben nem találtuk meg a polimorfizmust. Ugyanebben a régióban található CC16 gén, amelyben az első exon nem-kódoló régiójában találtak egy polimorfizmust, amely homozigóta formában 6,9-szeres, heterozigóta formában 4,2-szeres asztma kockázatcsökkenést okozott, összehasonlítva a publikált (vad) szekvenciára homozigótákkal. Azonban később ezeket az eredményeket sem tudták más populációkon, így a magyaron sem, megerősíteni.
2. Az MCP-1 kemokin asztmában betöltött szerepét számos állatkísérletes modell is megerősítette. Asztmás egyének tüdejében az MCP-1 fehérje szintje szignifikánsan emelkedett a nem asztmásokéhoz viszonyítva. A fehérje neutralizációja specifikus antitestekkel csökkenti a T-sejtek, eozinofilek szöveti beáramlását és a légúti hiperreaktivitást. Korábban több rendszeren mi is bizonyítottuk az MCP-1 jelentőségét asztmában. Az MCP-1 szabályozó régiójában található polimorfizmus gyakrabban fordult elő asztmás gyermekekben, mint nem-asztmás atópiás, illetve kontroll gyermekekben, sőt a polimorfizmus hordozó asztmások tünetei súlyosabbak voltak. Ezenkívül állatmodellünkön is az asztmás állatok tüdő MCP-1 expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll állatokban. Mindezen előzetes eredmények alapján döntöttünk úgy, hogy az RNSi kísérleteket ezzel a kemokinnal kezdjük.
Az RNS interferencia egy evolúciósan konzervált génexpressziót szabályozó folyamat, melyet először alacsonyabbrendű fonálférgeken, valamint növényekben figyeltek meg, később azonban kiderült, hogy a mechanizmus, bár molekuláris lépéseit tekintve ma még részleteiben nem teljesen ismert módon, emlősökben is működik. A sejtekbe bejutott dupla szálú, általában 21-23 bázispár hosszú dupla szálú RNS molekulák (úgynevezett rövid interferáló RNS-ek, siRNS) egy speciális enzimrendszer segítségével képesek a szekvenciájukkal homológ mRNS felismerésére és célzott degradációjára, ezzel blokkolva az adott gén kifejeződését. A hatás tranziens, osztódó in-vitro sejtkultúrák esetében 96 órán keresztül, in-vivo modellszervezetbe juttatva 7-14 napig is működhet a géncsendesítés. In-vivo bejuttatás történhet injekcióval (intradermálisan, intramuszkulárisan, farokvénába stb.), aeroszol formájában lélegeztetve, intratracheálisan, valamint vírusvektor segítségével is. Az siRNS molekulák módosítása különböző pontokon növeli a stabilitást, mely főleg in-vivo kísérletek esetében kulcsfontosságú.
Kísérleti rendszerünkben eddig különböző, az MCP-1 kemokinra specifikus módosított, úgynevezett Stealth siRNS szekvenciák in-vitro tesztelése történt meg LA-4 egér tüdő epitél sejtvonalon. A géncsendesítés mértékét quantitatív Real-Time PCR segítségével ellenőriztük, és ez alapján kiválasztottuk az MCP-1 mRNS-t leghatékonyabban blokkolni képes siRNS szekvenciát. Jelenleg az in-vivo kísérletek előkészületei folynak
Célkitűzések, kutatási terv
1. A jelenlegi asztma biobankunk gyarapítása évente mintegy 100 DNS mintával.
2. Az első SNP-vel szűrni kívánt genomterület a 11q13 lesz. Következőkben tervezzük még irodalmi adatok alapján választott jelölt génekben található SNP-k együttes vizsgálatát is. Későbbiekben potenciálisan szóba jöhető vizsgálandó genomterületek: 5q31-q33, 12q14.3-q24.31, 13q14, 14q11.2-q13, 17q11.2, melyek közül irodalmi adatok, illetve a vizsgálhatóság alapján választunk. Bioinformatikai módszerekkel a ’The SNP Consortium’, a ’Hapmap’ és a ’dbSNP’ honlapokat felhasználva olyan validált SNP-ket választunk ki, melyek alkalmasak a jelölt régiók szűrésére. Az egy genomterület szűrésére alkalmas optimális SNP mennyiséget (ha rendelkezésre áll) a Hapmap project eredményei alapján határozzuk meg. Az SNP-k kiválasztásánál figyelembe vesszük az SNP megállapított gyakoriságát, és azt hogy a Hapmap project keretében milyen haplotípusokat állapítottak meg az SNP környékén. Ezután az SNP körüli szekvenciát a Beckman Coulter által kiadott Autoprimer tutorialban leírt minőségellenőrzésnek vetjük alá. Az SNP-k meghatározásához szükséges 12-, vagy 48plex PCR primereket on line a felhasználói kulcsszóval védett http://www.autoprimer.com weboldalon keresztül terveztetjük meg. Az adatokat bioinformatikusok bevonásával értékeljük.
3. Ha az SNP szűrés alapján olyan géneket kapunk, amelyek asztmában betöltött szerepe nem ismert, megvizsgáljuk RT PCR, illetve Western blot segítségével, hogy milyen egérszövetben expresszálódnak (pl. melyik expresszálódik tüdőben?), változik-e expressziójuk az asztmásítás során, továbbá gén és adatbázisok segítségével in silico megpróbáljuk megjósolni a lehetséges funkciójukat, illetve a következő pontokban leírt módszerekkel is tanulmányozzuk.
4. Az RNSi kísérleteinkben először floureszcensen jelölt, nem génspecifikus kontroll siRNS molekulák segítségével szeretnénk az általunk választott intratracheális bejuttatás hatékonyságát igazolni, megerősítve ezáltal, hogy a bejuttatás ténylegesen a tüdőbe, mint célszervbe történik. Ezek után a megfelelő protokoll alapján asztmásított egerek MCP-1 specifikus siRNS kezelése következik, majd pedig a különböző vizsgálati paraméterek mérése (légúti hiperreaktivitás, tüdő szövettan, plazma, BAL szintek stb.). A géncsendesítés in vivo hatékonyságát mind mRNS szinten Real-Time PCR segítségével, mind pedig fehérjeszinten Western-blot technikával is igazolni szeretnénk. Terveink között szerepel az SNP Core Facility szomszédságában található Agilent Microarray Core Facility labor szolgáltatásait is igénybe venni. A génexpressziós microarray chip segítségével nyomon szeretnénk követni az asztmásítás, illetve az siRNS kezelés hatását a tüdő génexpressziókra.
5. A teljes genom génexpressziós microarray vizsgálatainkban kapott eredményeinket felhasználjuk a jelölt gén asszociációs vizsgálatainkban, azaz a szisztémás érzékenyítés, és a tüdő provokációk során szignifikáns expresszióváltozást mutató génekben bioinformatikai módszerekkel emberi SNP-ket keresünk és az SNPstream készülék segítségével megvizsgáljuk, hogy szerepet játszanak-e a humán asztma hajlamban. Ha az SNP szűréses vizsgálatainkban sikerül egy új jelölt gént találnunk szeretnénk azt is vizsgálni az asztma modellen az RNSi technika segítségével az előző pontban leírtak alapján.
Várható eredmények
1. Az asztmás betegek és az egészséges kontrollok DNS-én elvégzett SNP vizsgálatok segítségével azonosítani szeretnénk olyan géneket, illetve genetikai variációkat, amelyek szerepet játszanak az asztma pathomechanizmusában, illetve az asztmára való hajlamban. A rendelkezésünkre álló nagy teljesítményű genotipizáló készülék segítségével lehetőségünk nyílik korábban nem vizsgált, új „asztma gének” azonosítására. Az ilyen gének potenciális új gyógyszer támadáspontok lehetnek, melyek segítségével új asztma terápiás lehetőségek nyílhatnak meg.
2. Beállítunk egy olyan RNSi technikán alapuló in vivo módszert, amellyel különböző gének szerepe tanulmányozható asztmában. Ezzel a módszerrel, legalábbis részben kiváltható lenne, az időigényes és drága gén knock out (KO) módszer. A módszer segítségével az SNP vizsgálatokban kapott gének vizsgálatára nyílik lehetőség.
3. A beállított RNSi módszer, a génexpressziós mérések és a humán SNP vizsgálatok eredményei alapján új asztma terápiás lehetőségek, célpontok megjelölése.
felvehető hallgatók száma: 3
Jelentkezési határidő: 2018-09-20 |
|
|
|
|
Bejelentkezés
