|
|
 |
|
| Témakiírás |
| |
A kutatási téma leírása:
A vakuoláris proton-ATPáz (V-ATPáz) a rotációs enzimek membránhoz kapcsolódó biológiai makromolekulák családjába tartozik. A V-ATPáz normális funkciója az, hogy protonokat pumpál át bizonyos biomembránokon, és ez az összes eukarióta sejtben kulcsfontosságú rotációs enzim biztosítja az intracelluláris organellumok és egyes szövetekben az extracelluláris tér alacsonyabb pH-ját. Eukarióta endomembránok és plazmamembránok sokaságában történő lokalizációjuknak megfelelően a V-ATPázok sokféle transzportfolyamatot energizálnak. Mérete és összetettsége miatt a membránhoz kötött molekulagépezet szerkezet-funkció részleteinek megértése napjainkban a biofizika és a molekuláris biológia egyik legnagyobb kihívása. A V-ATPáz potenciális terápiás célpont számos betegségben is. Ismert, hogy a lizoszómák erősen savasak (a lizoszomális V-ATPáznak köszönhetően), de csak akkor, ha a sejteknek szükségük van lebontó funkciójukra. Például állatok éheztetése 3 órán át robusztus lizoszómás savasodást eredményez. Partnerünk (Juhász G., Momentum Drosophila Autophagy csoport, SZBK) előzetes munkája szerint a lizoszóma savasodásban a V-ATPáz bekapcsolása nem magyarázható az ismert szabályozó tényezőkkel. Feltételezik, hogy a beérkező lipidek is új szabályozó tényezők lehetnek. Ezért a lipid-fehérje kölcsönhatásnak nagy funkcionális jelentősége van, de ezt eddig senki nem vizsgálta egyik irányban sem, sem natív V-ATPázon, sem Vo-doménen. A spinjelző elektron paramagnetikus rezonancia (EPR) spektroszkópia számos egyedi előnnyel jár a membrán-fehérje kutatásban: natív és rekonstruált fehérjékben és membránokban alkalmazható; kicsi perturbációt okoz; a spektrumok értelmezése és illesztése tiszta; fehérjék, lipidek, inhibitorok, szubsztrátok mind spinjelezhetők; a dinamikáról ad adatokat a biomembránok számára optimális időskálán; nem kovalens kölcsönhatásokat is lehet vele tanulmányozni; és strukturális adatokat is szolgáltat. Ennek a témajavaslatnak az a célja, hogy vakuoláris vezikulákat használjon a V-ATPáz lipid-dinamikára gyakorolt hatásának tanulmányozására EPR-rel, valamint a lipidkörnyezet natív V-ATPázra gyakorolt hatásának tanulmányozására, egyúttal arra is összpontosítva, hogy az enzim aktivitását hogyan befolyásolja a natív lipid környezet változása. Előzetes eredményeink azt jelzik, hogy a lipid-dinamikát befolyásolja az enzim működése. Elkülöníthetjük az első héj és a szabad lipidek spektrális komponenseit, ha mindkettő szignifikáns. Tudjuk azonban, hogy a ConcA gátlóanyag önmagában is membránhatással bír, és a szubsztrátnak (ATP) is lehet némi hatása. A kihívás itt az, hogy elkülönítsük az inhibitor és a szubsztrát hatásait az enzim aktivitásától. Ezekkel a kérdésekkel az alábbi kutatási program alapján foglalkozunk:
• Kísérleteket fogunk végezni más olyan inhibitorokkal, amelyek kevésbé specifikusak a V-ATPázra, de várhatóan nem befolyásolják jelentősen a lipideket.
• Spinjelzett inhibitor analógokat használunk kötésük számszerűsítésére (a rotációs dinamikájuk változásai alapján), és korreláljuk a spin-jelzett lipidek spektrumának változásával.
• Csapdázott ATP-t használunk az extravezikuláris térben az enzim fény általi bekapcsolására az EPR rezonátorban. Ez lehetővé teszi a reakciók időzített vezérlését, valamint nagy felbontású különbségspektroszkópiát.
• Vizsgálni fogjuk a lipid spinjelzők különböző helyzetű izomerjeinek EPR spektrumait. A TEMPO pl. elválik a membrán és a vizes fázis között, így információt nyújt a membrán merevségéről és tömörségéről.
• A kísérleteket különböző hőmérsékleteken végzezzük az első héj és a szabad lipidek spektrumának jobb elkülönítése és a membrán fluiditása változtatása érdekében. A spektrumokat rutin algoritmusainkkal elemezzük, amelyek orientációs sorrend paramétert, rotációs korrelációs időt és relatív polaritást eredményeznek. Ezek a kísérletek megmutatják, hogy az első héj és a szabad lipidek hogyan reagálnak az enzim különböző funkcionális állapotaira.
• A lipid-fehérje kölcsönhatás fordított irányát illetően hipotézisünk az, hogy a V-ATPáz érzékeny a lipid környezetére, mivel a rotor felületének 2/3-a mindig érintkezik lipidekkel (a lipidek erős kötődése a rotorhoz blokkolja azt), és korábban egyértelmű szelektivitást tapasztaltunk a homárfehérje (a rotor c-gyűrűs modellje) esetében negatív töltésű lipidek irányában. Megvizsgáljuk a lipidek ATPáz aktivitásra gyakorolt hatását exogén lipidek hozzáadásával a natív vakuoláris membránhoz.
Kiválasztott közlemények:
Mosior, M., Mikołajczak, A. and Gomułkiewicz, J. (1990). The effect of ATP on the order and the mobility of lipids in the bovine erythrocyte membrane. Biochim Biophys Acta, 1022(3), 361-364.
Pali, T., Finbow, M.E., Holzenburg, A., Findlay, J.B.C., and Marsh, D. (1995) Lipid-Protein Interactions and Assembly of the 16-kDa Channel Polypeptide from Nephrops norvegicus. Studies with Spin-Label Electron Spin Resonance Spectroscopy and Electron Microscopy. Biochemistry 34(28), 9211-9218.
Kota, Z., Horvath, L. I., Droppa, M., Horvath, G., Farkas, T., & Pali, T. (2002). Protein assembly and heat stability in developing thylakoid membranes during greening. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99(19), 12149-12154.
Nishi, T. and Forgac, M. (2002) The vacuolar (H+)-atpases - Nature's most versatile proton pumps. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3(2), 94-103.
Marsh, D. and Pali, T. (2004) The protein-lipid interface: perspectives from magnetic resonance and crystal structures (review article) Biochimica et Biophyisica Acta - Biomembranes 1666(1-2), 118-141.
Pali, T., Dixon, N., Kee, T.P., and Marsh, D. (2004) Incorporation of the V-ATPase inhibitors concanamycin and indole pentadiene in lipid membranes. Spin-label EPR studies. Biochimica et Biophyisica Acta - Biomembranes 1663(1-2), 14-18.
Forgac, M. (2007) Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 917-929.
Xu, J., Cheng, T., Feng, H.T., Pavlos, N.J. and Zheng, M.H. (2007) Structure and function of V-ATPases in osteoclasts: potential therapeutic target. Histol Histopathol 22, 443-54.
Juhasz, G. and Neufeld, T.P. (2008) Experimental control and characterization of autophagy in Drosophila. Methods Mol. Biol. 445, 125-133.
Perez-Sayansa, M., Somoza-Martina, J.M, Barros-Angueirab, F., Reya, J.M.G. and Garcia-Garcia, A. (2009) V-ATPase inhibitors and implication in cancer treatment. Cancer Treatment Reviews 35(8), 707-713.
Takats, S., Nagy, P., Varga, A., Pircs, K., Karpati, M., Varga, K., Kovacs, A.L., Hegedus, K. and Juhasz, G. (2013) Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. J. Cell Biol. 201, 531-539.
Takats, S., Pircs, K., Nagy, P., Varga, A., Karpati, M., Hegedus, K., Kramer, H., Kovacs, A.L., Sass, M. and Juhasz, G. (2014) Interaction of the HOPS complex with Syntaxin 17 mediates autophagosome clearance in Drosophila. Mol. Biol. Cell 25, 1338-1354.
Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. (2015) Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends Biochem Sci 40, 611-622.
Nagy, P., Varga, A., Kovacs, A.L., Takats, S. and Juhasz, G. (2015) How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods 75, 151-161.
Sun-Wada, G.H. and Wada, Y. (2015) Role of vacuolar-type proton ATPase in signal transduction. Biochim Biophys Acta 1847, 1166-1172.
Kitazawa, S., Nishizawa, S., Nakagawa, H., Funata, M., Nishimura, K., Soga, T. et al. (2017). Cancer with low cathepsin D levels is susceptible to vacuolar (H+)-ATPase inhibition. Cancer Sci, 108(6), 1185-1193.
Lorincz, P., Mauvezin, C. and Juhasz, G. (2017) Exploring Autophagy in Drosophila. Cells 6.
Lorincz, P., Toth, S., Benko, P., Lakatos, Z., Boda, A., Glatz, G., Zobel, M., Bisi, S., Hegedus, K., Takats, S., Scita, G. and Juhasz, G. (2017) Rab2 promotes autophagic and endocytic lysosomal degradation. J. Cell Biol. 216, 1937-1947.
Pali, T. and Kota, Z. (2019). Studying Lipid-Protein Interactions with Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy of Spin-Labeled Lipids. Methods Mol Biol, 2019, 2013, 529-561.
előírt nyelvtudás: angol
felvehető hallgatók száma: 2
Jelentkezési határidő: 2023-06-12 |
|
|
|
|
|
|
|
Bejelentkezés
