|
|
 |
|
| Témakiírás |
| |
A kutatási téma leírása:
A vakuoláris proton-ATPáz (V-ATPáz) a membránhoz kötődő biológiai makromolekulák családjába tartozik, amelyek működése egyes részek valódi, teljes ciklusú rotációjával jár: a rotor forog más részekhez (ún. karhoz) viszonyítva. A V-ATPáz normális funkciója az, hogy protonokat pumpál át bizonyos biomembránokon, és az összes eukarióta sejtben ez a kulcsfontosságú rotációs enzim savanyítja az intracelluláris térrészeket és egyes szövetekben az extracelluláris teret. Eukarióta endomembránokban és plazmamembránokban való előfordulásának megfelelően a V-ATPázok sokféle transzportfolyamatot energizálnak. A V-ATPáz potenciális terápiás célpont számos betegségben. A V-ATPáz által történő protontranszport az ATP-ben tárolt kémiai energiából származik kötődés és hidrolízis útján, amely mechanikai erővé alakul, ami bizonyos alegységek csoportját forgatja a fehérjekomplexum többi részéhez viszonyítva. A Vo domén nagyon fontos a proton transzlokáció szempontjából, és az egyedi Glu aminosav a Vo c alegysége 4. hélixén helyezkedik el. Ez a membránon belüli régió azért is fontos, mert specifikus inhibítorok kötőhelyeit tartalmazza. A legspecifikusabb és legerősebb inhibitorok a bafilomicinek és a concanamicinek, amelyek gátolják az összes ismert eukarióta V-ATPázt. A concanamycin A (ConcA) kötődik a V-ATPáz intramembrán doménjához és blokkolja a rotációt, ennélfogva a proton transzportot is. A V-ATPáz a természet legsokoldalúbb protonpumpája. E projektben fő célunk a ConcA V-ATPázra gyakorolt hatásának új molekuláris részleteinek feltárása. Élesztő vakuoláris vezikulákban már meghatároztuk a ConcA natív V-ATPázhoz való kötődésének sztöchiometriáját. Ezekben a kísérletekben a kötődést közvetett módon az enzim gátlása bizonyította. A következő konkrét lépésekben végezzük a munkát:
• Mivel a lineáris gátlási régió még mindig meglehetősen korlátozott a NADH-t felhasználó ATPáz aktivitás méréseinkben, a korlátozás kiküszöbölésére az enzimatikus reakcióknak megfelelően illesztjük az ATP bomlási görbéket. Ha ez a kinetikai vizsgálat nem működik (mert például zavaró kölcsönhatás lép fel a kapcsoló enzimrendszer komponenseivel), akkor elektron paramagnetikus rezonancia módszert dolgozunk ki spinjelzett ATP vagy Mn-ATP felhasználásával.
• Ezután teszteljük azon hipotézisünket, miszerint a ConcA nem képes leállítani a járó motort, mégpedig úgy, hogy megváltoztatjuk a szubsztrát és a ConcA hozzáadásának sorrendjét. Ezen túlmenően, ha a szubsztrátkoncentráció alacsony, a V-ATPáz lépcsőzetes forgást végez, mivel a motornak meg kell várnia, amíg az ATP egy nyitott ATP zsebhez kötődik. Ennélfogva az ATP-koncentráció csökkentése (a felesleg szint alá) ezeket a készenléti periódusokat hosszabbá teszi, ennélfogva a ConcA-kötődés valószínűségét nagyobbá teszi, ezáltal a gátlás erősebbé válik. Arra számítunk, hogy magas ConcA koncentráció esetén a V-ATPáz gátlás élesen függ majd a szubsztrát koncentrációjától.
• Mivel az irodalomban nincs semmi a fénynek ConcA-ra gyakorolt hatásáról, ezért ezt is szeretnénk feltárni a V-ATPázra gyakorolt hatása kapcsán. A kiválasztott ATPáz aktivitás mérés alkalmazásával megvizsgáljuk, hogy a ConcA inaktiválható-e, és ezzel az élesztő vacuoláris vezikulákban intenzív fény által újra aktiválható-e a V-ATPáz (amelyet ConcA blokkolt). Ha igen, akkor teszteljük a hatás függését a fényintenzitástól és a hullámhossztól.
• Ez a tanulmány erős orvosi jelentőséggel bír. Ezért tesztjeinket vakuólumokon, élesztősejteken és végül rotifereken (a legkisebb állatokon) is elvégezzük a Datki Zs. által vezetettt kutatócsoporttal együttműködve (Szegedi Tudományegyetem, Pszichiátriai Intézet).
Kiválasztott közlemények:
Farina, C., and Gagliardi, S. (1999) Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase as novel bone antiresorptive agents [Review]. Drug Discovery Today 4, 163-172.
Nishi, T. and Forgac, M. (2002) The vacuolar (H+)-atpases - Nature's most versatile proton pumps. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3(2), 94-103.
Pali, T., Whyteside, G., Dixon, N., Kee, T.P., Ball, S., Harrison, M.A., Findlay, J.B.C., Finbow, M. and Marsh, D. (2004) Interaction of inhibitors of the vacuolar H+-ATPase with the transmembrane Vo-sector. Biochemistry 43(38), 12297-12305.
Pali, T., Dixon, N., Kee, T.P., and Marsh, D. (2004) Incorporation of the V-ATPase inhibitors concanamycin and indole pentadiene in lipid membranes. Spin-label EPR studies. Biochimica et Biophyisica Acta - Biomembranes 1663(1-2), 14-18.
Nakanishi-Matsui, M., Sekiya, M., Nakamoto, R.K., Futai, M. (2010) The mechanism of rotating proton pumping ATPases. Biochim Biophys Acta 1797, 1343-1352.
Ferencz, C., Petrovszki, P., Kota, Z., Fodor-Ayaydin, E., Haracska, L., Bota, A. et al. (2013). Estimating the rotation rate in the vacuolar proton-ATPase in native yeast vacuolar membranes. European Biophysics Journal, 42(2-3), 147-158.
Michel, V., Licon-Munoz, Y., Trujillo, K., Bisoffi, M., & Parra, K. J. (2013). Inhibitors of vacuolar ATPase proton pumps inhibit human prostate cancer cell invasion and prostate-specific antigen expression and secretion. Int J Cancer, 132(2), E1-10.
Vavassori, S., Mayer, A. (2014) A new life for an old pump: V-ATPase and neurotransmitter release. J Cell Biol 205, 7-9.
von Schwarzenberg, K., Lajtos, T., Simon, L., Muller, R., Vereb, G., and Vollmar, A. M. (2014). V-ATPase inhibition overcomes trastuzumab resistance in breast cancer. Mol Oncol, 8(1), 9-19.
Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. (2015) Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends Biochem Sci 40, 611-622.
Zhao, J., Benlekbir, S., Rubinstein, J.L. (2015) Electron cryomicroscopy observation of rotational states in a eukaryotic V-ATPase. Nature 521, 241-245.
Kitazawa, S., Nishizawa, S., Nakagawa, H., Funata, M., Nishimura, K., Soga, T. et al. (2017). Cancer with low cathepsin D levels is susceptible to vacuolar (H+)-ATPase inhibition. Cancer Sci, 108(6), 1185-1193.
Datki, Z. et al. (2018) Exceptional in vivo catabolism of neurodegeneration-related aggregates. Acta Neuropathol Commun 6, 6.
Datki, Z. et al. (2021) Exogenic production of bioactive filamentous biopolymer by monogonant rotifers. Ecotoxicol Environ Saf 208, 111666.
előírt nyelvtudás: angol
felvehető hallgatók száma: 2
Jelentkezési határidő: 2022-04-06 |
|
|
|
|
|
|
|
Bejelentkezés
