témavezető: Wikonkál Norbert
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem Bőrgyógyászati Klinika helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
Előzmények:
A bőrt leggyakrabban érintő ún. non-melanoma bőrrákok, a basalioma és a spinocelluláris carcinoma gyakorisága világszerte jelentős növekedést mutat. Ezen tumorok hátterében nagy jelentőségűek az UV hatásra specifikusan kialakuló ún. UV kézjegymutációk, különös hangsúllyal a p53 tumor szuppresszor gén mutációk szerepére. Bár epidemiológiai adatok ismeretesek, melyek szerint a fiatal korban elszenvedett excesszív UV-hatás csak évtizedek múltján vezet tumorok megjelenéséhez, a tumorigenesis egysejtes állapotától a kifejlett daganatig vezető út köztes alakjai azonban eddig kevéssé voltak modellezhetőek.
A Bőrklinikán egy olyan modellt állítottak be, amelyben az egér hátbőréről az epidermiszt az irháról leválasztva immunhisztokémiai festéssel a keratinocyták p53 statusa, azaz az elszenvedett DNS-károsodás megítélhető. Ezzel a módszerrel nemcsak a korábban vizsgált p53, hanem egyéb intercelluláris illetve intracelluláris fehérje expresszióját tudják vizsgálni.
Vizsgálni kívánjuk, hogy az epidermiszt érő krónikus ill. akut UV-hatásra létrejövő változások milyen változásokhoz vezetnek, ill. a már korábban is ismert p53 fehérjét érintő változások milyen útvonalakon keresztül valósulnak meg és hogy a p53-gén szintjén károsodott sejtek milyen dinamikával alakulnak valóságos tumorokká. Ehhez sejtkultúrás vizsgálatok mellett állatmodellt is használunk, ahol lehetőségünk van az UV fényforrás, a bőrt védő egyéb kémiai anyagok, illetve genetikusan módosított állatok használatával az örökletes tényezők szerepének tisztázására. Fenti folyamat további megismerése mellett tervezzük esetleges beavatkozási lehetőségek felderítését is.
Kutatási terv:
1.) UV-fényforrás: Eddigi vizsgálataink során széles spektrumú UVB fényforrást alkalmaztunk, amelynél Kodacell filter segítségével UVC kontaminációt kiszűrtük. Ezen készülék megépítése mellett tervezzük keskeny hullámsávú (Narrow-band) 311 nm-es fényforrás használatát is. A kísérletek során UVA fényforrás használatát is tervezzük.
2.) Sejtkultúrák: Vizsgálatainkhoz több sejtvonalat is alkalmazunk. Egyrészt a normál emberi bőrből kinyerhető primer humán keratinocitákat tenyésztjük, másrészt a humán keratinocitákból immortalizált HaCaT sejtvonalat használjuk. Az előbbit igen speciális tápfolyadékkal újszülött preputiumból tenyésztjük, a HaCaT sejtek egyszerű tápfolyadékkal könnyedén tenyészthetőek. Egyes esetekben frissen izolált fibroblasztok tenyésztésére is sor kerülhet.
3.) Állatmodell: C57/BL6 egerek vizsgálata. Tekintve, hogy az egér szőrzettel fedett, így a kísérletekhez első lépésként a szőr elektromos ollóval illetve borotvával való eltávolítása szükséges. Az egerek szőrzetét naponta kontrolláljuk, szükség esetén ismét borotváljuk őket. Az akut kísérletnél az egér egyszeri besugárzását követően 24h-val eutanáziára kerül sor. A krónikus besugárzás során heti egy- kétszeri borotválás szükséges. Minden alkalommal ügyelünk a borotválás során a hám károsításának lehető legkisebb mértékére. Az egereket naponta a kísérleti tervben meghatározott dózisú UV-sugárzással kezeljük. A kísérlet átlagos időtartama 4-11 hét között változik.
4.) Hatásmódosító anyagok: A naponkénti UV hatás krónikus effektusának megítélésében a humán tapasztalatok során alkalmazott kémiai anyagok UV-módosító hatását is vizsgáljuk. Ilyen anyagok az első generációs fényvédő készítményekben alkalmazott PABA, illetve ennek szintetikus származékai. Antioxidáns molekulák UV-fényvédő hatását is vizsgálni tudjuk, akár per os, akár lokális alkalmazással. Ilyen anyagok közül kiemelendő például az előző kísérleteink során UV-protektívnek bizonyult N-acetilcisztein, ill. BGP-15.
A sejtkultúrákat egyszeri UV dózisnak kitéve vizsgáljuk különböző időpontokban és dózisoknál a létrejövő fehérjeexpressziót Western blot technikával. A vizsgált tényezők egyike a HIF1 fehérje, amely a hypoxia válasz fontos regulátora és a tumorok kialakulása szempontjából kiemelt jelentőségű VEGF kulcs regulátora.
A fehérjeszintű vizsgálatok mellett vizsgáljuk az mRNS szintű változásokat is quantitativ PCR reakcióval, ahol a különböző időpontban és dózisban leadott UV besugárzás hatását vizsgáljuk a fehérjeszintű változások létrejötte előtti lépésben.
Sejtkultúrákban a fentiek mellett vizsgáljuk nagyobb target-gén populáció expresszióváltozását is potenciálisan érdekes egyéb útvonalak felderítésére.
Az állatkísérletes munka során az egér hátbőrét irradiáljuk, majd 24h elteltével az állatokat leöljük és a hátbőrükben észlelhető morfológiailag jól körülhatárolható apoptotikus sejteket, a sunburn sejteket vizsgáljuk. Egyes esetekben krónikusan besugárzott egerek esetén egy általunk kidoldozott módszerrel a hámot lapszerint szeparáljuk. A kísérlet lezárását egy egér esetén 2-9 héten belül tervezzük, az első esetben éppen láthatóak p53 pozitív sejtcsoportok, a 9 hétig besugárzott egereknél ezek a klónok több száz – akár ezer sejt méretűre nőnek.
Az általunk beállított modellrendszer hasznos az UV hatás tartós hatásainak megítélése, különösen az UV hatásra keletkező tumorok számának nagy mértékű növekedése miatt. Az állatmodell segítségével módunkban áll azonos körülményeknek és környezeti hatásoknak kitett állatok különböző időpontokban való vizsgálatával fenti folyamatok időbeni dinamikáját tanulmányozni. A korai szakaszban genetikus károsodások által elindított változásoknál a későbbiekben esetlegesen az immunrendszer bekapcsolódása is megtörténik a tumor elleni védekezésbe. Az ezt a folyamatot befolyásoló szisztémás és lokális hatások, antioxidánsok, tumorpromoveáló anyagok segítségével be tudunk avatkozni pozitív és negatív irányban ebbe a folyamatba. Az így szerzett információk nem csupán epidermális tumorok, de általános tumorkeletkezési folyamatok szintjén is betekintést nyújt a malignus folyamatok kialakulásába. Bőrtumorok mesterséges és kontrollált körülmények között való előidézése olyan általános érvényű összefüggésekre is fényt derít, amelyek belszervi malignomák esetén is fennállnak.
Bejelentkezés
