témavezető: Rozgonyi Ferenc
helyszín (magyar oldal): Semmelweis Egyetem, Bőr, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika helyszín rövidítés: SE
A kutatási téma leírása:
Klinikai mintákból izolált sarjadzó gombák azonosítása a MICRONAUT-Candida rendszerrel és a legújabb antifungális szerek fungicid hatásának vizsgálata a klinikailag jelentős Candida fajok ellen.
A sarjadzó gombák okozta magas mortalitással (30-40%) járó invazív gombafertőzések száma növekszik, a fertőzések 80-85 %-át különböző Candida speciesek okozzák.
A leggyakrabban izolált faj még mindig a Candida albicans, de a nem C. albicans fajok is egyre gyakrabban izolálhatóak. Az ilyen törzsek nagyobb gyakorisága miatt, a leggyakrabban alkalmazott antifungális szerektől nem mindig várható terápiás siker, a C.inconspicua esetén például a flukonazol nem bizonyult hatásosnak sem in vitro, sem in vivo vizsgálataink során.
Ugyanezt tapasztalható a korábban „gold standard”-nak tartott amphotericin B esetében is.
1). Vizsgálataink egy részének célja a fluconazol, illetve amphotericin B klinikai mintákból izolált sarjadzó gombákkal meghatározott in vitro fungicid vagy fungisztatikus hatás megerősítése idő-ölés görbék (time-kill curves) segítségével.
Vizsgálataink során klinikai izolátumokat és két tesztörzset használtunk: C.inconspicua (ATCC 16783) és C.norvegensis (ATCC 22977).
A fluconazol és amphotericin B MIC értékek a következő tartományban változtak: 16-128 mg/l és 0,5-1 mg/l . Az idő-ölés görbék meghatározásához 1-16x MIC koncentrációban használtuk a fluconazolt és az amphotericin B-t.
A vizsgálat eredményeként azt kaptuk, hogy a fluconazol fungisztatikus hatást fejt ki 4-16x MIC konentrációkat használva a 48 órás tenyészeteknél.
A fungicid végpont az amphotericin B esetében 1 mg/l koncentráció alkalmazásánál volt tapasztalható 2-24 órás tenyészeteknél.
Az in vitro eredmények az mutatják, hogy a flukonazol az emberi vérben elérhető koncentrációban hatástalan a C.inconspicuá-val szemben, ezzel ellentétben az amphotericin B jó lehetőségnek bizonyul a C.inconspicua okozta fertőzésekkel szemben.
A vizsgálatban alkalmazott és elsajátított módszerek:
-Az izolátumok azonosítását CHROMagar Candida, VITEK ID 32 és molekuláris biológiai módszerek segítségével, PCR ribotipizálással végeztük el.
-A minimális fungicid koncentráció (MFC) meghatározását a standard módszer segítségével végeztük.
A vizsgálatot microplateken végeztük, 48 órás inkubáció után a microplaten növekedést nem mutató üregeinek a teljes tartalmát Sabouraud-agarra oltottuk, majd 2 napig 350C-on inkubáltuk. Az MFC az az antifungális szer koncentráció, amelynél a kezdő csiraszám 99,9%-a elpusztul.
-Standard mikrodilúciós módszert használtunk a MIC meghatározáshoz.
-Az MFC értékek meghatározásával kapott fungicid vagy fungisztatikus hatás megerősítését az idő-ölés görbék segítségével végeztük. Ez egy Klepser és munkatársai által még 1997-ben standardizált metodika az in vitro ölő hatás vizsgálatára, amit nemzetközi, összehasonlító vizsgálatok alapján fogadtak el, mint az antifungális szerek ölő hatásának dinamikus modelljét. Az idő-ölés görbék segítségével meghatározható az az időtartam és antifungális szer koncentráció, amelyekben a szer fungisztatikus vagy fungicid hatása a legjobban érvényesül.
2/. A gombás fertőzések kezelésének problematikáján kívül komoly gondot jelent, hogy a leggyakrabban ferőző C.albicans faj mellett, a nehezen identifikálható Candida fertőzések száma évről évre növekszik. Ahhoz, hogy a kezeléseknél használt antifungális szernek sikeres terápiás hatása legyen, az identifikáló rendszernek gyorsnak, hatékonynak és megbízhatónak kell lennie.
A legtöbb, forgalomban lévő, kittel történő meghatározás időigényes, költséges, a DNS meghatározáson alapuló módszerek pedig a rutin laboratóriumokban nehezen hozzáférhetők.
A viszonylag egyszerűnek tűnő vizsgálati módszerek cukor asszimilációs teszteken és sarjadzó gombák morfológiai megjelenésén alapulnak (API ID 32C, API 20C, API Candida).
A legújabban MICRONAUT-Candida rendszert (Merlin Diagnosztika GmbH) a klinikai mintákban leggyakrabban előforduló sarjadzó gombák meghatározására fejlesztették ki.
A rendszer adatbázisa 31 faj meghatározását teszi lehetővé 6 nemzetségen belül.
A vizsgálati tesztsorozattal ellátott microplate rendszerben (8 kromogén szubsztrát, 14 szénhidrát asszimilációs teszt) 24 órás tenyésztés után bekövetkező változást a rendszerhez kapcsolódó MICRONAUT- leolvasó segítségével értékelhető.
Vizsgálataink során 264, klinikai mintából izolált sarjadzó gombafaj és a referencia törzsek kerültek meghatározásra egyidejűleg az API ID 32C és a MICRONAUT-Candida rendszerrel.
Amennyiben a két vizsgálatnál kapott eredményekben nagy eltérés tapasztaltunk, a PCR-ribotipizáló módszer használatára is sor került.
Eredményként megállapítható, hogy a MICRONAUT–Candida rendszer kiegészítő tesztek használata nélkül a 264 törzsből 247-et (93,5%) helyesen identifikált, kiegészítő vizsgálatok segítségével pedig 262 (99,2%) esetben bizonyult a rendszer alkalmasnak.
A vizsgálatok a következő tényekre engednek következtetni a MICRONAUT-Candida rendszert illetően:
- a MICRONAUT-Candida rendszer kiválóan alkalmas már 24 órás tenyésztést követően a klinikai gyakorlatban leggyakoribb Candida fajok azonosítására (C.albicans, C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei),
- kiválóan alkalmas kiegészítő tesztek beveztése nélkül a C.dubliniensis meghatározására, mely az utóbbi években igen gyakran felbukkanó flukonazol-rezisztens törzs lett,
- az API ID 32C rendszerrel kapott fals eredmények a C. lusitaniae- és C.famata- törzseket illetően ebben az esetben nem tapasztalható. Ez terápiás szempontból igen fontos, mivel a két faj eltérő érzékenységet mutat az azolok és az amphotericin B iránt
- igen pontos, megbízható eredményt ad a C.inconspicua estében, mely egy fokozottan flukonazol-rezisztens faj.
Bejelentkezés
