 |
|
| Thesis topic proposal |
| |
Description of the research topic:
1. Bevezetés
A TRPM2 kation csatorna, és a CFTR klorid ion csatorna egyaránt a „csatorna-enzimek” családjába tartozik. A Csatorna enzimek olyan transzmembrán fehérjék, melyek egy polipeptid láncon belül egyszerre ioncsatorna és enzim tulajdonságokkal rendelkeznek. Mivel mind a TRPM2 és CFTR csatornák működésének zavara humán megbetegedések kialakulásához vezethet, mindkét csatorna ígéretes célpont a gyógyszerfejlesztések során. Működésük részletes megismerése elengedhetetlen feltétele a minél hatékonyabb és specifikusabb aktiváló-, vagy gátlószerek kifejlesztésének, és jövőbeni terápiás célú alkalmazásának.
1.1 A TRPM2 csatorna szerkezete, funkciója és farmakológiája
A TRPM2 (Transient Receptor Potential Melastatin 2) a TRP fehérjék családjába tartozó ioncsatorna. Expresszióját leírták a központi idegrendszer neuronjaiban, csontvelőben, fagocitákban, hasnyálmirigy β-sejtjeiben és szívizomsejtekben, ahol oxidatív stressz hatására aktiválódó nem-szelektív, Ca2+ áteresztő kation-csatornaként működik. A funkcionális TRPM2 csatorna egy homotetramer, a feszültség-aktivált kation csatornákéhoz hasonló transzmembrán szerkezettel, és egy sajátos, nagyméretű intracelluláris résszel rendelkezik. Minden alegysége 6 transzmembrán régióból egy, a tetramerizációért felelős, ú.n. coiled coil régióból (CCR) és egy egyedi intracelluláris NUDT9H domain-ből áll. A NUDT9H egy ADP-ribóz (ADPR) kötő domain, szerkezetileg hasonló a Nudix hidrolázok családjába tartozó mitokondriális NUDT9 enzimhez. Ez az enzim egy aktív ADPR pirofoszfatáz, mely az ADPR-t AMP-re és ribóz-5-foszfátra hidrolizálja. A TRPM2 NUDT9H domain-je nem rendelkezik katalitikus aktivitással. Sejtből izolált membránokban mérve a TRPM2 csatornát Ca2+ és ADPR egyidejű, intracelluláris kötődése aktiválja. Intakt sejtekben az ADPR oxidatív stressz hatására szabadul fel a mitokondriumokból. A TRPM2 aktivitásának további feltétele a foszfatidil-inozitol-biszfoszfát (PIP2) jelenléte a membrán környezetben. A fagociták antigénnel való találkozása során a sejtekben reaktív oxigén fajták (ROS) keletkezése eredményeként aktiválódó TRPM2 csatornákon keresztül beáramló Ca2+ a sejtek kemokin termelésének és migrációs képességének a feltétele [1]. A hasnyálmirigy β-sejtjeiben a TRPM2 aktivitása a glükóz indukált inzulinszekréció ATP-kapuzott kálium csatornák által vezérelt folyamatát segíti elő. TRPM2 knockout egerekben magasabb nyugalmi vér glükóz szintet, és glükóz beadására annak túlzott megemelkedését mutatták ki [2]. A TRPM2 hőmérséklet függő aktivációja a hipotalamusz hőérzékeny neuronjaiban a test hőmérséklet szabályozásában játszik szerepet [3]. A csatorna aktivitása pathológiás, sejthalállal járó esetekben is szerepet játszik [4]. Agyi stroke és szívinfarktus során az iszkémiát követő reperfúzió során ROS képződik, mely hatására a TRPM2 csatornán beáramló Ca2+ a sejthalál beindításához vezet. A csatorna működése számos neurodegenerációs betegségben is szerepet játszik. Alzheimer-kór (AD) esetén a csatorna oxidációs stressz hatására történő aktiválódását írták le, ezzel szemben a Parkinson-kór (PD) és az amiotrófiás laterálszklerózis (ALS) betegekben a TRPM2 gén funkcióvesztéses mutációját [5], bipoláris zavarban szenvedő betegekben pedig a csatorna két további mutációját azonosították [6]. Mivel a TRPM2 működése elengedhetetlen a granulociták aktivációjához, a csatorna a krónikus gyulladások kezelése során is ígéretes hatóanyag célpont. Ezen felül, a TRPM2 aktivációja/gátlása a diabétesz vagy a veleszületett hiperinzulinizmus során jelenthet hatékony módot az inzulinszint szabályozására. A TRPM2 csatorna eddig bemutatott széleskörű ismerete ellenére a csatorna biofizikai és farmakológiai tulajdonságaival kapcsolatban további kérdések várnak megválaszolásra.
1.2 A CFTR csatorna szerkezete, funkciója és farmakológiája
A CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) klorid ion csatorna az ATP kötő kazettával (ABC) rendelkező transzporterek családjába tartozó fehérje. A csatorna két alegységből épül fel, melyek közül mindkettő rendelkezik egy-egy transzmembrán, és egy nukleotid kötő domain-nel (NBD). A két alegység a citoszolikus szabályozó (R) domain-en keresztül kapcsolódik össze. A csatorna transzmembrán pórusának nyitása és záródása (kapuzás) az R domain ciklikus AMP-függő kináz (PKA) általi foszforilációjához kötött,
és az NBD által végzett ATP hidrolizálásával szabályozott. A cisztás fibrózis (CF) betegséget a CFTR olyan mutációi okozzák, melyek következtében a fehérje szerkezete, sejten belüli szállítása, és/vagy a klorid csatorna funkciója sérül. Az 508-as fenilalanin hiánya a CF betegek megközelítőleg 90%-ában legalább egy allélban jelen van. Ez a mutáció mindkét defektust előidézi, vagyis a CFTR ΔF508 nagyban lecsökkent sejtfelszíni expresszióval és ehhez társuló, alacsonyabb nyitási valószínűséggel (Po) rendelkezik [7]. Ebből kifolyólag, a CF leggyakoribb változatának hatékony kezelésére egy kombinált, „korrektor” (expressziós szintet növelő), és „potencírozó” (Po-t növelő) stratégia a legmegfelelőbb. Az első, klinikai használatra engedélyezett CFTR potencírozó szer a Vx-770 (ivacaftor, Vertex Pharmaceuticals [8]), mely nagyban elősegíti a G551D mutáns CFTR spontán kapuzását, hatékony kezelést biztosítva a mutációt, és néhány további ritka allélt hordozó CF beteg számára [9]. Sajnos a ΔF508 mutációra homozigóta betegek esetében a Vx-770 és a Vx-809 (lumacaftor, Vertex Pharmaceuticals [10]) korrektor kombinációs alkalmazása csak enyhe javulást eredményezett [11]. Emellett in vitro kísérletekben kimutatták a két komponens a CFTR sejtfelszíni expresszióra tett antagonista hatását [12]. Ebből adódóan továbbra is nagy az igény a hatékonyabb potencírozó szerek kifejlesztésére. Dr Csanády munkacsoportjával részletesen karakterizálta a nagy hatékonyságú, de alacsony affinitású CFTR potencírozó molekula, az 5-Nitro-2-(3-fenilpropilamino)benzoát (NPPB) hatásmechanizmusát [13], és annak aktivitását meghatározó szerkezeti elemeit [14]. A molekula hatásmechanizmusát alapul véve a szerkezet tervezett módosításával képesek voltak a molekula affinitását a 85-szörösére javítani. A kísérletek folytatásában tervezzük a molekula hatásmechanizmusának lehető legrészletesebb feltérképezését és az ennek során szerzett információt felhasználva a molekulán végzett további szerkezeti módosításokkal további, még hatékonyabb változatokat létrehozni. Célunk az NPPB molekula lehető legjobb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkező változatának a létrehozása.
2. Kitűzött célok
2.1 A TRPM2 csatorna hőmérséklet érzékenységének vizsgálata humán membránban
Új kutatási eredmények igazolták TRPM2 csatorna szerepét a test hőmérséklet szabályozásában és a láz beindításában. A feltételezett mechanizmus a hipotalamusz preoptikus régiójában található hőmérséklet szabályozó központjában kifejeződő TRPM2 hőmérséklet érzékeny aktivációja. Emellett a csatorna aktivitása a hasnyálmirigy β-sejtjeiből történő inzulinszekréció hőmérséklet függésével is összefüggésbe hozható. Számos másik, a TRP családba tartozó fehérje (pl.: TRPA1, V1-3, M8) mutat saját hőmérséklet érzékeny működést, viszont a TRPM2 hőmérséklet érzékelésének biofizikai mechanizmusa a mai napig nem ismert. A kérdés megválaszolására két feltételezett modellt tervezünk vizsgálni: A TRPM2 hőmérséklet függése a csatornát aktiváló ligandok (ADPR, Ca2+, és PIP2) koncentrációinak hőmérséklet függésének a következménye, vagy a TRPM2 fehérje saját, direkt hőmérséklet érzékenységgel rendelkezik. Az utóbbi eset teljesülése esetén a csatorna ígéretes új célpontja lehet új típusú lázcsillapító szerek fejlesztésének. A TRPM2 saját hőmérséklet függése magyarázható a csatorna nyitás során fellépő nagy entalpiaváltozással, vagy a csatornát aktiváló ligandok iránti affinitásának megváltozásával. Mivel ez a kérdés mind biofizikai és terápiás
szempontból nagy jelentőséggel bír, célul tűztük ki a megválaszolását. Mivel a Xenopus oocita membránok 30°C felett instabillá válnak, a tervezett méréseket az előző pontban leírtaknak megfelelően, humán membránban (HEK-293) fogjuk elvégezni. Tervezzük a TRPM2 kapuzási paramétereinek (nyitási és zárási paraméterek, nyitási valószínűség), és ligand kötő (ADPR, Ca2+, és PIP2) affinitásának (K1/2) meghatározását inside-out patch konfigurációban 25, 30, 35, és 40°C hőmérsékleten.
2.2 Új CFTR potencírozó szerek tesztelése humán sejtmembránon
Az újonnan kifejlesztett CFTR csatorna potencírozó molekulák szerkezet-funkció tanulmányozásának első fázisát Xenopus laevis oocita membránon Dr. Csanády és munkatársai fogják elvégezi. A módszer kifejezetten hatékony a szükséges biofizikai mérések elvégzésére, mégis a fent említett hiányosságai miatt (a membrán lipid összetételének különbözősége és a membrán destabilizálódása 30°C feletti hőmérsékleten) az első fázisban kiválasztott molekulákat humán membránban kifejezett CFTR csatornákon is tesztelni fogjuk. Mivel az NPPB molekula kötőhelye nagy valószínűséggel a csatorna membránba ágyazott régiójában található, a membrán lipid összetétele befolyásolhatja a molekula membránban történő felhalmozódását, és megfelelő pozícionálását. Ebből kifolyólag a legígéretesebb NPPB analógokat natív membránkörnyezetben is fogjuk tesztelni, HEK-293 sejtekből izolált inside-out patch és teljes-sejt konfigurációkban.
Irodalomjegyzék
1. Yamamoto, S., et al., TRPM2-mediated Ca2+influx induces chemokine production in monocytes that aggravates inflammatory neutrophil infiltration. Nat Med, 2008. 14(7): p. 738-47.
2. Uchida, K., et al., Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes, 2011. 60(1): p. 119-26.
3. Song, K., et al., The TRPM2 channel is a hypothalamic heat sensor that limits fever and can drive hypothermia. Science, 2016. 353(6306): p. 1393-1398.
4. Nilius, B., et al., Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev, 2007. 87(1): p. 165-217.
5. Hermosura, M.C., et al., Altered functional properties of a TRPM2 variant in Guamanian ALS and PD. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(46): p. 18029-34.
6. McQuillin, A., et al., Fine mapping of a susceptibility locus for bipolar and genetically related unipolar affective disorders, to a region containing the C21ORF29 and TRPM2 genes on chromosome 21q22.3. Mol Psychiatry, 2006. 11(2): p. 134-42.
7. Szollosi, A., et al., Mutant cycles at CFTR's non-canonical ATP-binding site support little interface separation during gating. J Gen Physiol, 2011. 137(6): p. 549-62.
8. Van Goor, F., et al., Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(44): p. 18825-30.
9. Ramsey, B.W., et al., A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med, 2011. 365(18): p. 1663-72.
10. Van Goor, F., et al., Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(46): p. 18843-8.
11. Boyle, M.P., et al., A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med, 2014. 2(7): p. 527-38.
12. Veit, G., et al., Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med, 2014. 6(246): p. 246ra97.
13. Csanady, L. and B. Torocsik, Catalyst-like modulation of transition states for CFTR channel opening and closing: new stimulation strategy exploits nonequilibrium gating. J Gen Physiol, 2014. 143(2): p. 269-87.
14. Csanady, L. and B. Torocsik, Structure-activity analysis of a CFTR channel potentiator: Distinct molecular parts underlie dual gating effects. J Gen Physiol, 2014. 144(4): p. 321-36.
Deadline for application: 2022-10-10 |
|
|
|
|
Login
