Thesis supervisor: Csaba Tímár
Location of studies (in Hungarian): Élettani Intézet, Semmelweis Egyetem Abbreviation of location of studies: SE
Description of the research topic:
Háttér, Célkitűzések: Az extracelluláris vezikulákkal (EV) kapcsolatos kutatások volumene exponenciális növekedést mutat az elmúlt években. Az EV-k keletkezésén és jellemzésén túl egyre több közlemény taglalja ezek fiziológiás és patologiás jelentőségét: jelen ismereteink szerint alapvető és megkerülhetetlen szerepet játszanak a daganatos áttétképzés folyamatában, valamint az intercelluláris kommunikácóban. Az EV területén belül az immun eredetű, azon belül is a neutrofil granulocita (PMN) eredetű EV-k kutatása hasonló fejlődésen ment át. Korábbi munkám során a PMN eredetű EV-k és a PMN-ek elsődleges célpontjai, a baktériumok közötti kapcsolatot kutattam[1]. Ennek eredményeként Munkacsoportunk kimutatta, hogy jól meghatározott aktivációt követően keletkező neutrofil granulocita eredetű EV-k közvetlen antibakteriális hatással rendelkeznek, mely hatás mögött az EV-k baktériumokkal képzett aggregátumai állnak. Nyitva maradt azonban a kérdés, hogy mi a konkrét mechanizmus az antibakteriális hatás mögött: mitől függ az EV és a baktérium kapcsolódása, mitől a nagyobb aggregátumok kialakulása, illetve min alapul az antibakteriális hatás. Ennek megfelelően vizsgálni kivánjuk, hogy a korábban azonosított vezikuláris fehérjék közül mely található nagy mennyiségben az EV és a baktérium között, melyek nem, melyek gátlásával vagy mennyiségének fokozásával érhető el az interakció minőségének és mennyiségének változása, illetve azt, hogy mindez hogyan hat a baktériumok szaporodó képességére. Ezen túl szeretnénk meghatározni közvetlenül azon faktor(ok)at, melyek az antibakteriális hatást hordozzák.
A fenti mellett nem csak baktériumokra, hanem más, humán sejtekre gyakorolt hatását is vizsgálni kívánjuk a PMN eredetű EV-knek. Az EV-k intercelluláris kommunikációban betöltött szerepe jól dokumentált területnek számít [2, 3], azonban a PMN esetében a nemzetközi irodalomban leírt erdmények inkoherensnek tünnek. Ennek megfelelően – alapozva a különböző összetételű PMN EV-kről nyert ismereteinkre – vizsgálni kívánjuk, hogy mi állhat az irodalomban tapasztalható inkoherencia mögött. Kiemelten fontosnak tarjuk, hogy nem csak különböző stimulusra termelt EV-ket, hanem különböző állapotú PMN-ekből nyert EV-k hatásait is vizsgáljuk, és nem csak nyugvó, hanem különböző stimulusoknek kitett, különböző állapotú sejteken is. Külön figyelmet kívánunk fordítani a vezikulák összetétele, a célsejttel való interakció kialakítása és a célsejtre gyakorolt hatás kapcsolataira. Reményeink szerint az EV és a célsejt állapotának változtatásával, illetve az interakció mikéntjének követésével koherensebb képet kaphatunk a PMN eredetű EV-k intercelluláris kommunikációjában betöltött szerepéről.
A különböző állapotú célsejtek lehetséges jelentősége egy másik, szintén munkacsoportunkban zajló kutatás alapján merült fel. Ennek során a PMN-ek funkcionális eltéréseit kezdtük el felmérni súlyos bakteriális fertőzésben szenvedő betegekben. Voltaképpen meglepő, hogy az egyre komolyabb klinikai problémát jelentő antibiotikum rezisztencia mellett milyen kevés információ áll rendelkezésre a PMN működéséről emberek bakteriális fertőzéseiben. Külön problémája a területnek, hogy az állatmodellek eredményeit igen kis hatékonysággal lehetett eddig a humán folyamatok megértésében hasznosítani[4]. Ennek kapcsán kezdtünk kooperációba Egyetemünk Aneszteziológiai És Intenzív Terápiás Klinikájával. Ennek során súlyos szepszisben szenvedő betegek PMN-jeinek funkcionális állapotát vizsgáljuk igen sok (PMN életképesség, fagocitózis, alap- és indukált szuperoxid termelés, baktérium elimináció mennyiségi és minőségi eltérései) aspektusból, többek között a betegek állapotához való viszony szempontjából. Mindemellett vizsgáltu a betgek mintáinak PMN eredetű EV tartamát is. Meglepődve tapasztaltuk, hogy bizonyos funkcionális eltérések igen jól korreláltak a beteg állapotának súlyosságával, mely korreláció egészséges donorok PMN-jeire is átvihető volt a betegek vérplazmájával. Mindemellett a fenti betegek vérplazmájában igen emelkedett PMN eredetű EV tartamot tudtunk igazolni. A fenti kutatás jelnlegi céljában a fenti eltérések celluláris mechanizmusainak tisztázása, valamint a vérmintákban igazolt PMN eredetű EV-k vizsgálata áll.
Módszertan:
EV: A keletkezett EV mennyiségét részint Bradford fehérje meghatározással, részint áramlási citometriával követjuk [5, 6]. Az aggregációban részt vevő és részt nem vevő EV fehérjék minőségi és mennyiségi vizsgálatához – a megfelelő kalibrációs görbék alapján – jelzett, vagy más antitesttel jelezhető monoklonális antitesteket, valamint konfokális- és elektron mikroszkópos technikákat használunk, mely módszereket más mennyiségi különbségek kimutatására alkalmas módszerekkel (pl. ELISA, Western Blott) kívánunk kombinálni. A detektált fehérjék funkcionalitásának vizsgálatára megfelelő gátló-, illetve azokkal mechanizmusukban kompetáló anyagokat veszünk igénybe. Az antibakteriális hatás vizsgálatához a Munkacsoportunk által kifejlesztett félautómata baktériumnövekedési tesztet használjuk.
EV-sejt interakció: ennek követésére különböző fluorecens videómikroszkópos módszereket kívánunk használn a fenteb vázolt analitikai módszerek mellett. A kooperációben elvégzett proteomikai elemzések adataira támaszkodva kívánjuk az interakcióban feltehetőleg szerepet játszó molekulák mennyiségét kezelhető mértékűre szűkíteni.
Szepszis: a fentieken túl többféle módszert használunk a reaktív gyökök termelésének követésére (cytochrome c redukció, lumineszcens technikák). A fagocitózis mértékének meghatározásához fluorecens, opszonizált baktériumok PMN-en belül detektálható frakcióját vizsgáljuk áramlási citometriával. A sejtek életképességét Propidium Jodid és fluorecensen jelzett Annexin V kötődés alapján vizsgáljuk, szintén áramlási citometria segítségével.
A jelenlegi alapján reálisan várható eredmények haszna:
EV: Szeretnénk meghatározni azon molekulákat, melyek felelősek a baktérium-EV kapcsolatért, illetve amelyek e mellett, ill. ezen túl felelősek a közvetlen antibakteriális hatásért. Ezek alapján egy nem kihasznált elvi lehetőség nyílhat meg a baktériumok elleni küzdelemben.
EV-sejt interakció: szeretnénk megérteni, mely molekulák lehetnek felelősek ezért az interakcióért, és hogy milyen lehetséges módokon (felszíni receptrohoz kötődés, beolvadás a plazmamembránban vagy fagocitózis) jöhet létre ez az interakció.
Szepszis: szeretnénk meghatározni, mely faktorok felelősek a súlyos szepszisben tapasztalható PMN diszfunkciókért, szeretnénk vizsgálni ezek mennyiségét betegek mintáiban. A fenti vizsgálatok alapján könnyebb lenne olyan in vitro modelleket fejleszteni, mely segíti az emberi bakteriális fertőzések jobb megértését, valamint segítheti a PMN diszfunkcionalitás jelentőségének feltárását emberek súlyos bakteriális fertőzéseiben.
1. Timar, C.I., et al., Antibacterial effect of microvesicles released from human neutrophilic granulocytes. Blood, 2013. 121(3): p. 510-8.
2. Gasser, O. and J.A. Schifferli, Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood, 2004. 104(8): p. 2543-8.
3. Turbica, I., et al., Ectosomes from neutrophil-like cells down-regulate nickel-induced dendritic cell maturation and promote Th2 polarization. J Leukoc Biol, 2015. 97(4): p. 737-49.
4. Annane, D., et al., Recombinant human activated protein C for adults with septic shock: a randomized controlled trial. Am J Respir Crit Care Med, 2013. 187(10): p. 1091-7.
5. Lorincz, A.M., et al., Functionally and morphologically distinct populations of extracellular vesicles produced by human neutrophilic granulocytes. J Leukoc Biol, 2015. 98(4): p. 583-9.
6. Lorincz, A.M., et al., Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. J Extracell Vesicles, 2014. 3: p. 25465.
Deadline for application: 2020-10-17
2024. IV. 17. ODT ülés Az ODT következő ülésére 2024. június 14-én, pénteken 10.00 órakor kerül sor a Semmelweis Egyetem Szenátusi termében (Bp. Üllői út 26. I. emelet).
Login
