Thesis supervisor: Norbert Wikonkál
Location of studies (in Hungarian): SE Abbreviation of location of studies: SE
Description of the research topic:
A sejtek mitokondriumokban az oxidatív foszforiláció során az ATP képződés mellett természetes módon is keletkeznek szabadgyökök. A peroxid- és szuperoxid gyököket a sejtek saját antioxidáns rendszereikkel hatástalanítják. A szabadgyökök enzimatikus és nem enzimatikus kontroll alatt állnak. A szuperoxid-dizmutázok (SOD), kataláz, peroxidázok, glutation-S-transzferáz, reduktázok általi enzimatikus védekezést kiegészítik a másodlagos antioxidánsok, amelyek a már kialakult gyököket kötik meg. Ilyenek például az E, A és a C vitamin, a húgysav, albumin, bilirubin, glutation és a flavonoidok. Bizonyos helyzetekben, mint például stressz, betegség vagy idős kor, a szabadgyökök mennyisége megnő. Emellett exogén tényezők, környezeti ártalmak, mint például az UV sugárzás, is hozzájárulnak a fokozott szabadgyök képződéshez. Az oxidatív stressz a szövetek és sejtek öregedéséhez, oxidatív immunválaszok létrejöttéhez, valamint számos további kórfolyamat, mint pszichiátriai, neurológiai, kardiovaszkuláris és daganatos megbetegedések kialakulásához vezethetnek. Megelőzés céljából gyakran az antioxidáns bevitel növelésére tesz az ember kísérletet mesterséges antioxidáns vegyületek szisztémás vagy lokális alkalmazásával. Ezek közül a C-vitamin a legismertebb antioxidánsok egyike. Az utóbbi évek kutatásai azonban rámutattak, hogy az aszkorbinsav sokoldalúbb annál, mint ahogy azt addig gondolták. Koncentrációtól és alkalmazási módoktól függően potens prooxidánsként is viselkedhet. Ezáltal magas koncentrációban szelektív citotoxikus hatással bírhat in vitro és in vivo egyaránt. Feltételezések szerint a képződő szuperoxid és hidrogén peroxid, illetve a Fenton reakció által katalizált hidroxil gyökök felelősek a hatásért. Ezáltal a C-vitamin tumor és egyéb arra érzékeny sejtekben vagy mikroorganizmusokban nekrózis szerű sejthalálhoz vezethet. Másik lehetséges útvonal az energiahiányos állapot létrejötte mely különböző enzimatikus útvonalak aktiválásával elhasználja a sejt metabolikus készleteit ATP depléciót okozva. A tumor sejtek, mikroorganizmusok szelektív érzékenységét elsősorban a direkt glikolízisre épülő anyagcseréjük magyarázhatja, mivel a kevésbé hatékony glikolízisből nyerik az ATP-t laktát felhalmozódás mellett. Ezen túl daganatokban további lehetséges támadáspont az érújdonképződésben kiemelt jelentőséggel bíró növekedési faktorok, mint a VEGF, bFGF és IL-8 szintjének csökkentése. Ezen túl az aszkorbinsavnak aktív fertőzés elleni hatása is lehet. Súlyos gombás fertőzésekben potencírozta az antimycoticus terápiák hatását. Itt részben a fentiekhez hasonló prooxidáns hatásmechanizmuson keresztül hathat megfelelő koncentrációban. Mindezek mellett további kutatások vannak folyamatban, mely az aszkorbinsav terápia egyéb hatásait vizsgálják, mint pl. myocardiális infarktus utáni reoxigenizáció javításában, vagy súlyos égési sérültek újraélesztési sikerességének javításában.
Kutatásunk célja a hibás antioxidáns rendszerrel bíró kísérleti állatok daganatképződésének, bőröregedésének követése. Vizsgáljuk ezen kívül szisztémásan és lokálisan alkalmazott antioxidáns készítmények hatásait az említett egértörzsben, továbbá egyéb bőrbetegségekben. Ezen felül célunk a különböző koncentrációkban alkalmazott szisztémás C-vitamin terápia alkalmazhatóságának és hatásosságának vizsgálata fertőző, illetve daganatos betegségekben
Kutatási terv:
1.) Genetikailag módosított, mangán szuperoxid dizmutáz deficiens egereken tervezzük a szabadgyök képző UVA besugárzás rövid és hosszú távú következményeit vizsgálni. A fokozottabb oxidatív stressz eléréséhez a besugárzás hatását szabadgyök képző, fényérzékenyítő anyaggal potencírozzuk. Kontroll egerekkel összehasonlítva vizsgáljuk a mutáns egerek bőröregedését és bőr daganatok kialakulását.
2.) A fentiek mellett lokálisan alkalmazott EUK-134 szuperoxid dizmutáz mimetikum, és szisztémásan alkalmazott C-vitamin antioxidáns védelmek hatásosságát vizsgáljuk az említett káros hatások kivédésében. A kialakuló elváltozásokból, illetve az egészségesnek tűnő bőrből is mintákat nyerünk. Szövettani vizsgálat és multiplex citokin assay segítségével vizsgáljuk a gyulladásos folyamatokat, az epidermális és kötőszöveti károsodásokat. Emellett molekuláris biológiai módszerekkel vizsgáljuk a photocarcinogenesis és photaging hátterét kezelt és kezeletlen egerek mintáiban gén expressziós profilok összevetésével.
3.) További vizsgálatainkhoz az in vitro és in vivo kísérletekben alkalmazott C-vitamin koncentrációkat az irodalmi adatok alapján állapítjuk meg.
4.) In vitro hatások vizsgálata sejtkultúrákon: Vizsgálatainkban több sejtvonalat is alkalmazunk. Egyrészt a normál emberi bőrből kinyerhető primer humán keratinocitákat tenyésztünk, másrészt keratinocitákból immortalizált HaCaT sejtvonalat használunk. Emellett YPD agaron Candida albicans tenyészetet hozunk létre 30 °C-on. A sejt és gombatenyészeteken a táphoz adott aszkorbinsav hatásait követjük. A sejt és gombakultúrákat különböző időpontokban vizsgáljuk koncentráció függően. A létrejövő fehérje expressziót Western blot és ELISA technikával vizsgáljuk. A fehérjeszintű vizsgálatok mellett vizsgáljuk az mRNS szintű változásokat is quantitativ PCR reakcióval, ahol a különböző időpontban és koncentrációban adott C-vitamin hatását vizsgáljuk a fehérjeszintű változások létrejötte előtti lépésben. Emellett vizsgálni tervezzük a sejtek redox státuszát, többek közt a NADH autofluorescenciájának meghatározásával, melyet két foton mikroszkóppal nézünk.
5.) In vivo hatások vizsgálata bőrdaganatokban szenvedő betegeken: Az intravénás C-vitamin terápia magas dózisú alkalmazása lokálisan előrehaladott, egyéb kezelési lehetőségekkel nem gyógyítható bőrdaganatok esetében. Szigorú beválasztási és kizáró kritériumok alapján határozzuk meg a vizsgált betegkört. Irodalmi és korábbi kísérletes adatok alapján kidolgozzuk a centrális vénába történő gyógyszeradás metodikáját. Követjük a terápia hatásosságát és a terápia előtt, közben és után vér, valamint szövetmintákat gyűjtünk. Az in vivo kísérlet alkalmával gyűjtött mintákon az előzőek mellett szövettani vizsgálatot végzünk. Összehasonlítjuk a kezelés előtti és utáni állapotokat. A mintákat speciális immunhiszokémiai festésekkel is elemezzük. Többek közt proliferáció és apoptózis markereket nézünk, mint a caspase3 és Ki67, valamint az ér újdonképződés csökkenését követjük CD31 és VEGF A antitestekkel. Emellett vizsgáljuk a VEGF angiogenesis marker szérumszintjét és annak változásait a kezelés hatására.
Kísérleteinkkel célunk az endogén és exogén antioxidáns rendszerek szerepének meghatározása bőrbetegségek és bőrdaganatok kialakulásának, megelőzésének és kezelésének esetében. Célunk továbbá új antioxidáns vegyületek vizsgálata, és a már korábban is alkalmazott prooxidáns terápia különböző hatásmechanizmusainak pontosabb megismerése. Ezen felül célunk az in vivo kezelések klinikai biztonságosságának és alkalmazhatóságának megítélése, valamint az alkalmazás módjának meghatározása.
Login
