ODT - témakiírás: Krenács Tibor: Prognosztikai és prediktív faktorok ...

Prognosztikai és prediktív faktorok vizsgálata in situ fehérje, ill. gén szinten: immunhisztokémiai és fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) jeleinek mennyiségi és min

TÉMAKIÍRÁS

Intézmény: Semmelweis Egyetem
elméleti orvostudományok
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

témavezető: Krenács Tibor
helyszín (magyar oldal): SE Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet
helyszín rövidítés: SE

A kutatási téma leírása:

Bevezetés
Az emlőrákok 10-15%-a a tripla negatív (TNBC: triple negative breast cancer) szubtípusba sorolható, melyekre nevükből eredően az ER, PR és HER2 negativitás jellemző. Emellett ¾ részükben bazális CK 5 (14) pozitivitás figyelhető meg. [1.] Prevalencia tekintetében gyakrabban érintettek fiatal (< 50 év), afrikai-amerikai, alacsonyabb szocioökonómiai helyzetű elhízott nők. Molekulárisan genetikai instabilitás, szövettanilag általában magasabb proliferációs index, magasabb grade (G3), klinikailag gyakoribb recidíva (1-3 éven belül) és áttétképződés jellemzi, tehát viselkedése agresszívebb, mint a többi emlőrák szubtípusé. Egyesek neoadjuváns kemoterápiára, mások célzott terápiára jól reagálnak, melyeknél magas a komplett patológiai válasz aránya (pCR: pathological complete response). A reziduális tumorok 90%-ában kimutatható valamilyen “driver” mutáció.
Molekuláris szempontból jelenleg a tripla negatív emlőrákokat 6 altípusba sorolják: bazális 1-es, bazális 2-es, immunmodulált, mesenchymalis, mesenchymalis őssejt-szerű és luminalis androgén receptor pozitív. [2.] Az immunmodulált típus a legjobb, míg a mesenchymalis típus a legrosszabb prognózisú.
A tripla negatív emlőrákok tehát egy heterogén betegségcsoport, ahol az onkogenezis és progresszió során számos szabályozási útvonal deregulációját figyelték meg. Az eltérő biológiai viselkedés és terápiás érzékenység miatt indokolt tehát biomarkerek kutatása a klinikailag releváns alcsoportok lehetséges elkülönítése céljából.
A vizsgálandó biomarkerek
1. Sejtstresszválaszok valamit a DAMP potenciális markerei
A sejtek normális körülmények között és malignus transzformáció után is túlélési mechanizmusokat működtetnek, a külső, illetve a belső stressz leküzdésére. A legismertebb ilyen mechanizmusokat a hősokk fehérjék és egyéb ún. “chaperon” fehérjék (pl. calreticulin) felülregulációja közvetíti. Ezek feladata a fehérjék funkcionális konformációjának védelme. Irreverzibilis károsodás sejtpusztulási folyamatokat, így pl. programozott sejthalált (apoptózis), nekrózist és autofágia által közvetített sejthalált okoz. Apoptózis kapcsán a hősokk és a “chaperon” fehérjék tumorantigén fragmentumokhoz kötődve kiszabadulnak a tumorsejtekből és ún. DAMP (damage associated molecular pattern) szignálokként viselkednek. [3.] Mivel specifikus receptoraik találhatók az antigénprezentáló dendritikus sejteken (DC vagy APC), támogatják a tumorantigének felvételét, processzálását és bemutatását mind az MHC-I, mind az MHC-II-es molekulákon, ezzel aktiválva a citotoxikus T-sejteket és a CD4 pozitív “helper” sejteket. Az így fokozott tumorellenes immunitás immunogén sejthalált (ICD - immunogenic cell death) közvetít.
A HSP70 chaperonként működik, és a sejtekben a fehérjék szintéziséért, konformációjának kialakításáért, transzportjáért, degradációjáért felelős. A sejteket ért stressz hatásra azonban a cytoplasmából a sejtmembránba transzportálódik, ott DAMP-ként funkcionál és különböző útvonalak aktiválásán keresztül (NK-sejtek, CD 8+ T-sejtek stimulálása, proinflammatorikus cytokinek felszabadulása, DC sejtek érésének elősegítése) vezet immunogén sejthalálhoz.
A calreticulin egy kalciumkötő fehérje az endoplasmatikus retikulumban (ER), chaperon, ami a hibás fehérjék vándorlását akadályozza meg az ER-ból a Golgiba. Stressz hatására kiszabadul a cytoplasmába, a sejtmembránba transzlokálódik, és ott ún. “eat me” szignálként funkcionál az antigénprezentáló sejtek számára.
A HMGB1 (high mobility group box-1) fehérje egy sejtmagi nem-hiszton fehérje, ami a DNS-hez kötődve támogatja a génátírást. Irreverzibilis stressz hatására kiszabadul a sejtmagból, a cytoplasmán keresztül a sejtfelszínre, majd az extracelluláris térbe jut, támogatja a gyulladást, az antigénprezentáló sejtek antigénfelvételét, érését, és a T-sejtek aktiválását. [4.]
A sejtekben az apoptózis két különböző úton mehet végbe. [5.] Megkülönböztetünk extrinsic (külső) és intrinsic (belső, mitokondriális) útvonalat. Az előbbiben extracellularis ingerek pro-apoptotikus receptor (pl. Fas, TLR2R) stimulációján keresztül a caspase 8 (cisztein-aszparaginsav-proteáz), egy iniciátor fehérjét aktiválják. Ez direkt vagy indirekt (a mitokondrialis apoptózis aktiválásán keresztüli) úton aktiválja a caspase 3-at, ami végrehajtó fehérjeként működik, endonukleázok aktivációja során a DNS fragmentálódásához vezet.
Az intrinsic út, amit erőteljes stressz, DNS sérülés vagy cytotoxikus ágensek felszaporodása stimulál, a mitokondriumon keresztül megy végbe. A Bcl-2 a mitokondrium külső membránján helyezkedik el, anti-apoptotikus fehérje, a sejt túlélését segíti. Ezzel szemben a BAK és/vagy a BAX fehérjék felszaporodására a mitokondrialis külső membrán permeabilitása megnő, és pro-apoptotikus fehérjék, többek között cytochrom c szabadul fel, melynek hatására apoptosoma képződik, ami caspase 3-at aktivál (hasított-caspase-3 formájában).
Az AIF1 egy caspase független mitochondriumban elhelyezkedő NADH oxidáz, mely sejt stressz hatására a cytoplasmába, ezután a sejtmagba transzlokálódik, majd aktiválódik, és ott endonukleázokat aktivál, illetve maga is képes fragmentálni a DNS-t.
A sejtciklus szabályozásában az egyik legfontosabb tumorszupresszor fehérje a p53, mely a DNS stabilitását őrzi, a sejtciklus ellenőrzőpontokban (pl. G1/S) képes beavatkozni. A sejtet ért károsodás hatására a p53 transzkripciós faktorként aktiválódik, és a p21 aktiválásán keresztül sejtciklus stoppot idéz elő. Amennyiben a DNS károsodás javítása sikeres, úgy a p53 lebomlik, és a sejtciklus a következő fázisba léphet. Amennyiben sikertelen, úgy a sejt apoptózisát indukálja. [6.] A vad típusú p53 féléletideje olyan rövid, hogy standard immunhisztokémiával nem detektálható. Azonban a mutáns p53 fehérje nem tud lebomlani, a féléletideje megnő, felszaporodik, és magi pozitivitást ad immunhisztokémiai reakcióval. P53 mutáció gyakran figyelhető meg hólyag, colon, tüdő, emlő és más carcinomákban, illetve astrocytomákban, leukémiákban, sarcomákban és mesotheliomákban is.

2. RANK-RANKL/OPG jelút biomarkerei
Újabb vizsgálatok utalnak a RANK-RANKL jelút aktivitásának szerepére emlőcarcinomák progressziójában és biológiai viselkedésében, különös tekintettel a TNBC daganatokban. Ezért célszerű tanulmányozni a jelút aktivitásának és biomarker szintjének összefüggéseit a TNBC daganatok progressziójával és kimenetelével.
A klasszikus osteoclastogenikus RANK/RANKL jelút aktiválása szerepet játszik az öröklődő BRCA1/2 mutáció vezérelte emlőcarcinomák kialakulásában (Nolan és mtsai, 2016). A célzott RANK-L gátló Denosumab monoklonális antitest-terápiát sikeresen alkalmazzák csontáttétes daganatok például emlőcarcinomák terjedésének és a kísérő osteolitikus lézióinak gátlására. A kezelésnek potenciális szerepe lehet a BRCA1 mutáns bazális emlőcarcinomák prevenciójában is.
- A BRCA1 mutáció alapján kialakuló bazális emlőcarcinomák aberráns c-Kit pozitív luminális progenitorsejt populációt tartalmaznak, amely autonóm növekedést mutat (Lim és mtsai, 2009).
- A BRCA1 mutáns bazális emlőcarcinomák onkogenezisében és az aberráns/fokozott progeszteron receptor expresszió fontos szerepet játszik. Vad típusú BRCA1 gén gátolja a PR aktivitást (Ma és mtsai, 2006). Ezért progeszteron antagonista kezeléssel egérben gátolható a BRCA1 mutáció alapján kialalkuló emlőcarcinoma (Poole és mtsai, 2006). BRCA1/2 mutáns betegek szérum ösztrogén és progeszteron szintje szignifikánsan magasabb, mint a vad BRCA1/2 gént hordozóké (Widschwendter és mtsai, 2013).
- A TNF családba tartozó RANKL (vagy TNFSF11) a progeszteron szignál paracrin közvetítésének alapvető faktora (Tanos és mtsai, 2013), ugyanakkor receptora a RANK is bizonyítottan szerepet játszik az emlő carcinogenezisében (Pellegrini és mtsai, 2013).
- BRCA1 mutáns betegek normál emlőszövetében RANK-, ill. RANK+ progenitor sejtek azonosíthatók, utóbbiak fokozott proliferációt mutatnak (Nolan és mtsai, 2016). Háromdimenziós preneoplasticus BRCA1 mut/+ organoid tenyészetben Denosumab kezelés szignifikánsan gátolta a progeszteron indukálta sejtproliferációt. BRCA1 deficiens egérben a RANKL gátlás ugyancsak gátolta a tumoigenezist. Tehát a RANKL gátló Denosumab kezelés célzottan blokkolja a daganat progenitorsejteket BRCA1 mutáns emlőszövetben/carcinomában.
Módszerek és kutatási terv
Kutatásunkban a sejt stressz (hsp70, calreticulin, HMGB1) és az apoptózis útvonalak (p53, AIF1, bcl-2, cytochrome C, aktivált caspase-3 és caspase-8) közvetítő fehérjéinek, valamint a RANK-RANKL és a RANKL kötő csapda receptor OPG expresszióját vizsgáljuk 111 klinikailag követett CK 5 (14) pozitív (bazális-szerű) tripla negatív emlőcarcinomában, melyek a Bács-Kiskun Megyei Kórház Patológiai Osztályáról származnak (TUKEB engedély: BMEÜ/443-5 /2022/EKU). A kiválasztott esetek archivált szövetblokkjaiból duplikált “core”-okkal szöveti multiblokkokat (TMA - tissue microarrays) készítünk. A TMA metszeteken immunhisztokémiai módszerrel, az előzőekben felsorolt fehérjékre specifikus antitestekkel, Roche-Ventana Ultraview immunfestő automatával végezzük a reakciókat, magas pH-jú (CC1) antigénfeltárás után. Az immunreakciókat teljes metszet digitalizálás után értékeljük az intenzitások és a pozitív tumorsejtek gyakoriságának figyelemebevételével. Az eredmények és a túlélési adatok között korrelációkat keresünk. Eredményeinket összehasonlítjuk az in silico KM-plotter adatbáziskezelő software (http://kmplot.com/analysis/ ) segítségével az Affimetrix mRNA expressziós platformból nyert szabadon hozzáférhető adatbázisok (pl. GEO) adataival [7.]. Az in silico mRNA adatbázisból kapott adatokat a recidívamentes túléléssel (RFS - recurrence-free survival), míg az in situ immunhisztokémiával vizsgált fehérjék adatait a teljes (OS - overall survival), illetve a progressziómentes túléléssel (PFS - progression-free survival) tudjuk összehasonlítani.

Irodalom
1. Barok M, Jorma I, Palyi-Krekk Zs, Nagy P, Juhasz I, Vereb Gy, Kauraniemi P, Kapanen A, Tanner M Szollosi J (2007): Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance.. Molecular cancer therapeutics. 6, 7.: 2065–72.
2. Baselga J Albanell J (2001): Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies. Annals of oncology. 12, Suppl 1.: 35–41.
3. Baselga J, Swain S M (2009): Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nat Rev Cancer 9:463-475.
4. Bose R, Kavuri SM, Searleman AC, Shen W, Shen D, Koboldt DC, Monsey J, Goel N, Aronson AB, Li S, Ma CX, Ding L, Mardis ER, Ellis MJ (2013): Activating HER2 mutations in HER2 gene amplification negative breast cancer. Cancer Discov. 3:224-37.
5. Chen X, Duan N, Zhang C, Zhang W (2016): Survivin and Tumorigenesis: Molecular
Mechanisms and Therapeutic Strategies. J Cancer. 2016, 7:314-323.
6. Downward J (2003): Targeting Ras signaling. Nat Rev Cancer. 3:11-22.
7. Lim E, Vaillant F, Wu D, Forrest NC, Pal B, Hart AH, Asselin-Labat ML, Gyorki DE, Ward T, Partanen A, Feleppa F, Huschtscha LI, Thorne HJ; kConFab, Fox SB, Yan M, French JD, Brown MA, Smyth GK, Visvader JE, Lindeman GJ (2009): Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nat Med. 15:907-913.
8. Ma Y, Katiyar P, Jones LP, Fan S, Zhang Y, Furth PA, Rosen EM (2006): The breast cancer susceptibility gene BRCA1 regulates progesterone receptor signaling in mammary epithelial cells. Mol Endocrinol. 20:14-34.
9. Narayan M, Wilken JA, Harris LN, Baron AT, Kimbler KD, Maihle NJ (2009): Trastuzumab-induced HER reprogramming in "resistant" breast carcinoma cells. Cancer Res. 69:2191-2194.
10. Nolan E, Vaillant F, Branstetter D, Pal B, Giner G, Whitehead L, Lok SW, Mann GB (2016): Kathleen Cuningham Foundation Consortium for Research into Familial Breast Cancer (kConFab), Rohrbach K, Huang LY, Soriano R, Smyth GK, Dougall WC, Visvader JE, Lindeman GJ. RANK ligand as a potential target for breast cancer prevention in BRCA1-mutation carriers. Nat Med. 2016 Jun 20. doi: 10.1038/nm.4118.
11. Pellegrini P, Cordero A, Gallego MI, Dougall WC, Muñoz P, Pujana MA, Gonzalez-Suarez E (2013): Constitutive activation of RANK disrupts mammary cell fate leading to tumorigenesis. Stem Cells. 31:1954-1965.
12. Poole AJ, Li Y, Kim Y, Lin SC, Lee WH, Lee EZ (2006): Prevention of Brca1-mediated mammary tumorigenesis in mice by a progesterone antagonist. Science. 314:1467-1470.
13. Tanos T, Sflomos G, Echeverria PC, Ayyanan A, Gutierrez M, Delaloye JF, Raffoul W, Fiche M, Dougall W, Schneider P, Yalcin-Ozuysal O, Brisken C (2013): Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 2013 Apr 24;5(182):182ra55.
14. Van de Ven S., Smit V. T. H. B. M., Dekker T. J. A., Nortier J. W. R. és Kroep J. R. (2011): Discordances in ER, PR and HER2 receptors after neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Cancer Treatment Reviews. 37: 422–430.
15. Widschwendter M, Rosenthal AN, Philpott S, Rizzuto I, Fraser L, Hayward J, Intermaggio MP, Edlund CK, Ramus SJ, Gayther SA, Dubeau L, Fourkala EO, Zaikin A, Menon U, Jacobs IJ (2013): The sex hormone system in carriers of BRCA1/2 mutations: a case-control study. Lancet Oncol. 14:1226-1232.

Jelentkezési határidő: 2024-08-31